DCCIK联合化疗治疗结肠癌的临床研究

　　[摘要]目的:研究树突状细胞(Dendriticcells，DCs)和细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokineinducedkiller，CIK)联合化疗治疗结肠癌的临床疗效和免疫功能变化。方法:将40例入选病例随机分为单纯化疗组和联合治疗组，化疗组20例，仅行化疗[奥沙利铂(Oxaliplatin)+亚叶酸钙(CF)+5-氟尿嘧啶(5-FU)];联合组20例，给予DC-CIK联合化疗[奥沙利铂+亚叶酸钙+5-氟尿嘧啶]。比较两组患者治疗后局部复发率、生存率和毒性反应。流式细胞术检测T细胞亚群的比例、ELISA法检测细胞因子表达水平。评价DC-CIK免疫治疗的安全性。结果:联合组治疗后局部复发率低于化疗组(P0.05)，1、2年生存率高于化疗组，无明显差异(P0.05)。化疗组治疗后外周血中CD8+比例升高，CD4+/CD8+比值下降，IL-6升高(P0.05);而联合组治疗后外周血中CD4+、CD16+、CD56+、CD4+/CD8+比值显著升高，CD4+CD25+调节性T细胞比例显著下降，IFN-γ显著升高(P0.05)，联合组患者治疗后周围神经毒性、胃肠道反应明显轻于化疗组(P0.05)。DC-CIK细胞回输过程中及回输后未见明显不良反应。结论:DC-CIK免疫治疗联合化疗，有可能降低术后复发和转移，提高结肠癌患者的免疫功能，减轻毒性反应，具有较高的安全性。

　　目前，全球结肠癌的发病率及死亡率处于上升趋势，手术及术后辅助化疗可减缓结肠癌疾病进展。手术及多周期化疗后，患者机体免疫功能受到不同程度的损伤，自体细胞免疫治疗成为结肠癌的重要治疗手段[1]。

　　树突状细胞是功能强大的专职抗原提呈细胞(Antigenpresentingcell，APC)，可高效介导对特异性抗原的免疫应答。细胞因子诱导的杀伤细胞具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和非主要组织相容性复合体(MHC)限制性杀瘤的优点。DC-CIK细胞联合培养，具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广的优点。本研究通过DC-CIK联合化疗治疗结肠癌，旨在探讨DC-CIK免疫治疗在实体瘤治疗中的有效性和安全性。

　　1资料与方法

　　1.1一般资料病例入选标准:①按国际抗癌联盟(UICC)年分期标准结肠癌TNM分期为Ⅱ、Ⅲ期术后患者;②所有病例术后病理检查证实均为腺癌;③卡氏评分KPS≥70分;④无严重心肺、肝、肾等内科疾病;⑤治疗前常规行腹部CT、全身骨ECT、心电图、血常规及肝肾功能检查正常。收集年1月至年12月就医院肿瘤科的40例Ⅱ～Ⅲ期结肠癌患者符合入选标准，其中男28例，女12例，年龄35～77岁。随机选取20例作为单纯化疗组，仅行化疗，20例作为联合治疗组，给予DC-CIK联合化疗。两组一般情况比较差异无统计学意义(P﹥0.05)，见表1。本临医院伦理委员会审查批准，全部受试患者均签署知情同意书。

　　1.2主要仪器与试剂流式细胞仪FACSCalibur(美国BD公司);COBESpectra血液成份分离机(美国GambroBCT公司);酶联免疫酶标仪(丹麦DenkeyDragon);Ficoll淋巴细胞分离液(美国Sigma公司);T淋巴细胞亚群检测试剂盒(古巴分子免疫学中心);抗人IFN-γ、IL-2、IL-6ELISA试剂盒(上海森雄科技有限公司)。

　　1.3DC-CIK细胞培养DC的体外诱导成熟:用血细胞分离机采集患者外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs)，调整细胞密度为2×ml-1，置于37℃、5%CO2培养箱中培养2小时，将悬浮细胞移出，向培养瓶中加入GM-CSF、IL-4，每2天换液1次，并补充相关细胞因子，第6天加入IFN-γ，诱导DC成熟。CIK细胞的体外诱导和扩增:以同样方法采集供者PBMC，用AIMV无血清培养基调整细胞浓度为4×ml-1，置于37℃、5%CO2培养箱培养2小时。收集悬浮细胞，计数并用RPMI培养液调细胞浓度为1×ml-1，第1天加入IFN-γ，24小时后加入CD3McAb及IL-2，每2天换液1次。DC和CIK共培养:第8天将收获成熟的DC与CIK细胞按照1∶10比例混合共培养6天。细胞培养第0天及每次收集细胞回输前取1ml样品进行免疫表型检测。

　　1.4治疗方案单纯化疗组:化疗方案:奥沙利铂mg/m2，静滴2小时滴完，第1天;CFmg/m2，第2～6天;5-Fumg/m2，静滴4～6小时，第2～6天，21天为1周期，根据患者情况术后辅助化疗4～6个周期。联合治疗组:患者行化疗前2天血细胞分离机单采外周血单个核细胞，培养DC-CIK细胞。第3天起开始行化疗。细胞培养第13天时，经细菌、真菌及内毒素检测阴性后收集细胞，将收集的细胞用无菌生理盐水洗涤3次后混悬于含2%白蛋白的ml生理盐水中，于第14～16天连续回输3天，1次/天，每次1.5小时内回输完毕，共接受2个疗程DC-CIK细胞治疗。

　　1.5T细胞亚群及细胞因子水平测定抽取两组患者治疗前后外周血，应用流式细胞术检测T细胞亚群中CD3+、CD4+、CD8+、CD16+CD56+效应细胞的比例及CD4+CD25+调节性T细胞比例。ELISA法检测细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-6的表达水平，按试剂盒说明书操作。

　　1.6疗效评定指标治疗期间定期复查血常规、肝肾功能、肿瘤标志物及结肠镜、腹部B超、螺旋CT，必要时行PET-CT检查以了解肿瘤复发、转移等情况。随访两组患者的局部复发率、生存率。通过测定T细胞亚群及细胞因子水平，评估机体免疫功能的改善情况。比较两组患者周围神经毒性、骨髓抑制、胃肠道反应发生率，毒性反应按WHO()统一标准分为0～Ⅳ度。观察每次输注DC-CIK细胞过程中及回输后患者有无发热、过敏等不良反应。

　　1.7统计学分析数据以x±s表示，采用SPSS17.0统计软件包，进行t检验，率的比较采用χ2检验，P0.05表示有统计学意义。

　　2结果

　　2.1比较治疗后局部复发率、生存率单纯化疗组随访20例，联合治疗组随访20例，化疗组局部复发率高于联合组，有统计学差异(P0.05)，而1、2年生存率低于联合治疗组，比较无明显差异(P﹥0.05见表2。

　　2.2治疗前后对患者外周血T细胞亚群的影响两组患者治疗前后外周血T细胞亚群的变化如表3所示，其中化疗组治疗后外周血CD3+、CD4+、CD16+CD56+效应细胞和CD4+CD25+调节性T细胞有变化但无显著差异(P﹥0.05)，CD8+效应细胞比例升高，CD4+/CD8+比值下降(P0.05);而联合组治疗后外周血CD4+(见图1)，CD16+CD56+效应细胞的比例(见图2)和CD4+/CD8+比值显著升高(P0.05)，CD8+效应细胞比例下降但无显著差异(P﹥0.05)，CD4+CD25+调节性T细胞比例显著下降(见图3，P0.05)。

　　2.3治疗前后对患者细胞因子的影响如实验结果(表4)示，化疗组治疗后IL-6升高(P0.05)，IFN-γ、IL-2降低，但无显著差异。联合组治疗后IFN-γ较治疗前显著升高(P0.05)，IL-2和IL-6变化无明显差异。

　　2.4DC-CIK联合化疗的安全性评价两组患者治疗后相关毒性反应主要为周围神经毒性、骨髓抑制、胃肠道反应。Ⅰ～Ⅱ度周围神经毒性，主要表现为感觉迟钝和(或)感觉异常(可逆转);Ⅰ～Ⅱ度胃肠道反应主要表现为恶心、呕吐(可控制)。联合组发生率低于化疗组(P0.05)。骨髓抑制以Ⅰ～Ⅱ度白细胞减少为主，应用重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)后可继续完成治疗。化疗组和联合组发生率无显著差异(P﹥0.05，见图4)。在DC-CIK细胞回输过程中及回输后，仅1例患者出现发热，体温38.2℃，持续时间约3～5小时，经对症处理后缓解;未观察到胸闷、低血压、过敏、休克等不良反应，未出现明显肝肾功能、凝血功能受损。

　　3讨论

　　结肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，术后辅助化疗对控制局部复发转移有显著作用，但化疗药物只能杀灭一定比例的肿瘤细胞，很难清除微小残留病变，最终需联合免疫治疗进一步提高疗效。结肠癌患者的免疫功能常呈现抑制状态，免疫功能越低，越会发生“免疫漂移”(Immuneshift)改变[2]，即Th1/Th2平衡失调并向Th2转化，严重影响机体的抗肿瘤能力。成熟T细胞属异质性群体，两个主要亚群，即辅助性T细胞(Th)CD4+和抑制性细胞(Ts)CD8+，CD4+Th细胞根据其分泌细胞因子的不同，分为Th0、Th1、Th2三个亚型。Th0细胞是未成熟的前体细胞，向Th1、Th2细胞分化。Th1细胞主要分泌IL-2、干扰素-γ(Interferon-gamma，IFN-γ)和肿瘤坏死因子α、β(Tumornecrosisfactor-α、β，TNF-α、β)，而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10。近年来又报道了Th3亚型[3]，可大量分泌TNF-β、IL-4和IL-10，下调APC及Th1细胞活性，诱导免疫耐受。CD3存在于所有T细胞表面，可反映CD4+和CD8+T细胞的总体水平。CD4+Th细胞介导细胞毒有关的免疫应答，促进B细胞增殖、分化及产生抗体。一般认为，肿瘤患者外周血的CD8+细胞主要是抑制性T细胞。CD4+/CD8+比值可作为判断机体免疫功能状态的一项重要指标。结肠癌患者CD4+/CD8+比值变小，表明机体免疫功能低下，可能与肿瘤细胞分泌免疫抑制因子，诱导CD8+的产生，同时阻止CD4+的形成和成熟[4]，降低机体抗肿瘤免疫有关。CD4+CD25+调节性T细胞作为免疫抑制细胞，参与肿瘤的免疫逃逸，抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖和活化[5]。肿瘤患者外周血、肿瘤浸润淋巴结调节性T细胞比例升高。NK细胞的特征性表型主要是CD16+CD56+，是机体免疫监视系统的重要组成成份，NK细胞数量减少减弱了机体的免疫机能。

　　研究表明，化疗药物诱导的调亡肿瘤细胞能有效诱发免疫应答，对随后的免疫治疗起到增益作用[6]。Marten等[7]发现将同源DC和CIK细胞共培养后，DC和CIK细胞的增殖能力及CIK细胞的杀伤活性均明显增强。树突状细胞刺激初始T细胞(naiveTcells)活化增殖，诱导抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞成熟[8]。绝大多数肿瘤患者存在DC数量减少和功能障碍，提示体外诱导足够数量的功能强大的DC用于纠正患者的免疫缺陷成为一种可能。CIK可特异地聚集于肿瘤局部发挥靶向抗肿瘤作用;分泌大量的Th1类细胞因子[9]，如IFN-γ、IL-2及IL-12，促进肿瘤细胞对CIK杀伤作用的敏感性;还能分泌IL-6、TNF-α及GM-CSF等细胞因子，增强细胞毒作用。大量研究表明，DC与CIK细胞共同培养后，DC的抗原提呈及激发机体免疫应答的能力提高，CIK的增殖活性和细胞毒作用增强[10]。

　　本文基于对单纯化疗与DC-CIK联合化疗治疗Ⅱ、Ⅲ期结肠癌同期对照研究，治疗前两组患者临床资料无显著差异，治疗后化疗组局部复发率高于联合组，而1、2年生存率低于联合组，无明显差异，可能是因为病例数较少，随访时间较短，有待今后扩大样本量进一步随访获得相应临床数据。应敏刚等[11]对Ⅰ～Ⅲ期结肠癌术后患者进行了相关研究，DC-CIK联合组和对照组中位生存期分别为63个月(95%CI，55～72)、52个月(95%CI，42～62)，Kaplan-Meier生存曲线和Logranktest检验结果表明，联合组生存期明显长于对照组(P0.05)。因此，联合DC-CIK可降低局部复发率，有可能提高患者的生存率，延长生存期。

　　从两组患者治疗前后T细胞亚群检测结果看，联合组治疗后外周血CD4+/CD8+比值升高，CD4+CD25+调节性T细胞比例下降，说明联合治疗可使结肠癌患者免疫功能得以恢复与提高，进一步杀伤化疗后那些残存的肿瘤细胞。Th1细胞分泌的IFN-γ可抑制Th2细胞增殖，Th2细胞分泌的IL-6可下调Th1细胞的活性，导致免疫障碍。新近研究显示，DC-CIK联合治疗可增加IFN-γ的表达[12]。本研究与此研究结果一致。DC与CIK细胞共培养后，DC与CIK细胞均被进一步激活，IL-2、IFN-γ分泌显著升高，增加抗肿瘤效应。

　　此外，联合组患者Ⅰ～Ⅱ度周围神经毒性、胃肠道反应发生率较化疗组明显降低，并在免疫细胞回输过程中仅1例患者出现发热，未发现其他不良反应。因此，DC-CIK联合化疗治疗结肠癌是安全有效的，不仅活化了体内T细胞，增强了肿瘤杀伤力，同时下调了CD4+CD25+调节性T细胞的免疫抑制性，破坏了肿瘤复发、转移的内环境，提高机体整体免疫功能，有良好的应用价值和治疗前景。（来源：中国免疫学杂志）

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