医用三氧辅助治疗肿瘤相关理论基础
医用三氧辅助治疗肿瘤可行性报告(3)
——医用三氧辅助治疗肿瘤相关理论基础（A）
导语
世界各地大部分恶性肿瘤发病率和死亡率呈上升趋势，目前治疗恶性肿瘤的手段和方法有很多，如外科手术、放射治疗、化学药物治疗、生物治疗、介入治疗、热疗、中医中药治疗等。这些治疗手段对恶性肿瘤都有一定疗效，部分治疗也带来较重的副反应。三氧疗法是否适用于肿瘤的辅助治疗？现作一分析评估。
第一节肿瘤微环境与肿瘤
1肿瘤微环境的概况
正常细胞与其周围的组织环境之间存在动态平衡，两者共同作用可以调控细胞活性，决定细胞增殖、分化、凋亡以及细胞表面相关因子的分泌和表达[1]。而肿瘤发生恶变的过程则是不断打破这一平衡的恶性循环过程。肿瘤细胞无限增殖，就需要不停地建立适于自己生长的外部组织环境。而随着恶变的演进，肿瘤外部组织环境中的营养条件已不能满足肿瘤生长的需求；这时肿瘤细胞可以通过诱导血管生成等途径不断构建新的营养代谢网路，促进肿瘤细胞的生长，这一规律贯穿于整个肿瘤进展的过程，是肿瘤不断恶变并发生转移的基础[2]。
肿瘤微环境是一个复杂的综合系统，它由许多基质细胞组成，包括成纤维细胞、免疫和炎性细胞、脂肪细胞、胶质细胞、平滑肌细胞以及一些血管细胞等[3]。这些细胞可以被肿瘤细胞诱导，在其周围产生大量的生长因子、细胞趋化因子以及基质降解酶，有利于肿瘤细胞的增殖和侵袭。
2肿瘤微环境定义
肿瘤微环境（tumormicroenvironment）指肿瘤在生长过程中，由肿瘤细胞及细胞外间质相互作用后形成的特殊环境，其具有肿瘤组织内血供不平衡、间质压力较正常组织高、营养物质相对缺乏的特点。形成这些特点的关键因素就是促血管生成因子和血管生成抑制因子的平衡失调并向前者倾斜[4]。这种陷入恶性循环的微环境是肿瘤的特征之一，也是临床肿瘤治疗的难点。
肿瘤的恶性微环境使得其对化疗药物敏感性下降，这一特点限制了抗肿瘤化疗药物的疗效。最有效的抗肿瘤化疗要使肿瘤细胞能充分接触细胞毒性药物并且产生最大的细胞毒效应。因此，肿瘤微环境的正常化可以增加抗肿瘤细胞毒性药物的疗效。
另外，肿瘤的转移是恶性肿瘤的主要临床特征之一，也是临床抗肿瘤治疗的难点，无论是基础研究还是临床治疗，都缺乏有效且实用的手段。肿瘤微环境趋向正常化后，肿瘤间质压力下降，驱使肿瘤细胞淋巴转移的动力因素解除，使肿瘤病人能够临床获益。医院观察到抗血管化疗能够减少Lewis肺癌的转移，并能延长小鼠的生存时间。
3肿瘤微环境与肿瘤恶变
3.1肿瘤微环境生物学特征
组织缺氧和酸中毒、间质高压形成，大量生长因子和蛋白水解酶的产生及免疫炎性反应等构成了肿瘤组织代谢环境的生物学特征，这种特性对于肿瘤的增殖、侵袭、迁移、黏附及新生血管的形成具有重要影响，是肿瘤不断恶变并发生转移的重要原因。
肿瘤本身能够通过一些途径对抗血管药物产生耐受性，其中包括上调各种补偿性促血管生成信号通路、招募促血管生成炎性细胞或血管周细胞和增强肿瘤细胞的侵袭性[5]。
3.2肿瘤基质影响着肿瘤的恶性表型
肿瘤基质由基底膜、免疫细胞、毛细血管、成纤维细胞以及肿瘤周围的细胞外基质共同构成[6]，其结构与外伤愈合时形成的肉芽组织很相似，所以Dvorak等[7]称肿瘤是“不可治愈的外伤”。机体组织内环境稳态的保持，需要胞外网络提供结构支持以及细胞与细胞之问的持续联系。肿瘤细胞与肿瘤基质之阆的相互对话在肿瘤的恶变进程中起到了重要的作用。
肿瘤细胞通过产生大量的生长因子和蛋白水解酶调节着肿瘤基质环境并以旁分泌的形式诱导血管生成[8]和炎症反应[9]，同时，还可以激活肿瘤基质中的各型细胞而活化肿瘤基质，比如成纤维细胞、平滑肌细胞[10]脂肪细胞[11]等。基质细胞活化后会分泌胰岛素依赖性生长因子-1（insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1）、肝细胞生长因子（HGF）等多种细胞因子，对肿瘤的恶性转化起促进作用。所以，肿瘤基质决定着肿瘤的恶性表型。
3.3间质高压决定着肿瘤微血管的高渗特性
不同于正常的组织，人和动物的肿瘤组织都呈现组织高压状态。研究发现，两种机制促进肿瘤高压的形成[12]：一是肿瘤组织中缺乏功能性淋巴系统。正常组织中淋巴系统具有调节组织液动态平衡的作用。Diresta等[13]研究发现，将人工淋巴系统植入肿瘤，可使肿瘤组织的高压水平降低。二是肿瘤血管具有高渗的特性。研究发现肿瘤血管具有不同于正常血管的特点，如内皮细胞不完整或缺失、基底膜中断或缺失、血管形成不均匀分布、毛细血管间距增大、动静脉短路、间质内液体增多以及血液粘度增加等，这些超微结构的改变，使得肿瘤血管的舒缩性能丧失，管壁脆性增高，血管阻力增大；血液浓缩，间质内液体增多，血细胞外渗粘性阻力增大，最终出现肿瘤间质高压。虽然肿瘤血管具有高渗的特性，但是在不同的肿瘤组织之间，同一肿瘤组织的不同进展阶段，这种渗透性的程度都是不同的。
3.4肿瘤营养代谢的改变影响着肿瘤的演进
肿瘤组织代谢环境的两个基本特征是组织缺氧和酸中毒。早在年，Thomlinson等[14]就发现恶性肿瘤内存在的肿瘤细胞处于低氧状态。恶性肿瘤增长迅速，一方面，肿瘤细胞凋亡的速度明显低于其所对应的正常组织，从而使得它对氧以及其他葡萄糖等能量物质的需求增加；另一方面，肿瘤体积高度膨胀，一部分肿瘤组织逐渐远离具有丰富营养来源的血管而出现血供不足，导致这一部分肿瘤组织缺氧。临床发现，大部分恶性肿瘤生长、发展过程中都存在内部缺氧区域，而且这些区域常常出现坏死，也更容易发生肿瘤转移。肿瘤组织缺氧区域中的缺氧诱导因子1a（hypoxia-induciblefactor-1a，HIF-1a）处于高表达状态。研究发现HIF-1a表达与肿瘤的恶性程度及其相关，已成为重要的抗肿瘤转移的靶标。应用HIF-1a单克隆抗体进行免疫组化，结果显示，HIF-1在许多肿瘤细胞中表达升高[15]。GantherG[16]在有关乳腺癌的研究中发现HIF-1a处于高表达，而脑（少突神经胶质细胞瘤）、子宫、口咽、卵巢癌的研究显示，HIF-1a的过度表达与病人死亡率明显相关[17]。此外，HIF-1a对血管生成以及肿瘤侵袭、转移都有影响。HIF-1a上调会使血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）表达升高[18]。Kelly等[19]在心肌缺血研究中发现，HIF-1a是调节血管生成的重要因子，控制着多种血管生成生长因子的表达；MelilloG等[20]研究发现，在肿瘤抑癌基因缺失的4型肾细胞癌中，HIF-1a能够增加编码3种转录B钙粘素抑制物的mRNA的表达，降低肿瘤细胞之间的同型黏附，有利于肿瘤细胞的迁移。
除低氧微环境外，肿瘤细胞的旺盛生长同时伴随着大量酸性代谢产物的外排，从而形成肿瘤细胞外的酸性环境。肿瘤细胞具有很强的适应性，能迅速适应缺氧环境：三羧酸循环发生障碍，无氧糖酵解释放大量乳酸，以及肿瘤组织周围不完备的脉管系统，使分解代谢产物不能及时排除，都促成肿瘤组织周围酸性环境的形成，而这种环境有利于肿瘤的转移。年Schlappack等[21]利用实验性动物转移模型，将3种细胞KHT、SCG-VII和B-16首先在一定的酸性条件下培养，然后分别从尾静脉注入C57BL/6小鼠，23d后发现3组动物肺部的转移结节数与正常培养细胞组有显著性差异；TarabolettiG等[22]在肿瘤血管生成的研究中发现，肿瘤细胞表面可以向内皮细胞分泌一种转运VEGF的小囊泡，PH值越低越有利于小囊泡对于VEGF的摄取。
3.5免疫炎性反应参与和调节肿瘤的发展
流行病学专家多年研究慢性炎症与肿瘤的关系，发现在结肠癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌等多种癌症中会联合出现慢性炎症[23]。肿瘤的恶变中有许多炎性免疫细胞的参与和调节，其中起主要作用的是机体的固有免疫细胞。
固有免疫细胞释放到微环境，在肿瘤恶变中起重要作用。固有免疫细胞主要来源于骨髓，包括巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞等，这些细胞释放化学趋化因子、血管生长因子、基质降解酶等，形成有利于肿瘤生长和侵袭的微环境[24]。同时，这些炎性细胞可以通过产生活性氧和氮类，形成一种细胞DNA的损伤剂——过氧亚硝酸盐，从而加强肿瘤基因的不稳定性引起基因突变[25]。乳腺癌及膀胱癌中，趋化因子配体2（chemokinecc-fotifligand2，CCL2）的表达与预后不良呈正相关[23]；单核巨噬细胞主要的生长和分化因子——集落刺激因子1（CSF1）在子宫、卵巢、前列腺癌中高表达[26]。近年的研究表明，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）是主要的广泛存在于各种肿瘤中的造血生长因子，它们不但可以在体内募集单核巨噬细胞、中性粒细胞等到达肿瘤临近的部位促进肿瘤发展进程，还可以诱导肿瘤血管生成，主要的方式为招募正常的内皮祖细胞到达肿瘤组织[27]。研究发现炎性细胞中，中性粒细胞对于诱导肿瘤血管生成的作用最强，可以通过分泌基质金属蛋白酶9（MMP9）和基质金属蛋白酶13（MMP13）的方式降解重塑基底膜发挥作用[28]。
3.6微环境中多因子影响着肿瘤血管生成
“血管生成之父”Folkman[29]认为，当肿瘤直径长至1-2mm时，肿瘤组织会诱导血管生成以满足自身无限增殖的营养需求。目前研究表明，不管是肿瘤增殖的营养和代谢条件，还是作用于血管生成的重要因子都存在于肿瘤微环境中。研究较多的因子是HIF-1，它不仅可以作用于VEGF，而且对PDGF、白介素-8（IL-8）等均有作用。肿瘤微环境也可以直接影响肿瘤细胞自身血管生成因子的表达。如碱性成纤维生长因子（bFGF）的表达和种植瘤的部位有关，将人肾型细胞癌细胞接种于裸鼠的肾脏，表达的bFGF要比接种于正常皮下的高10～20倍，在肾脏更容易形成血管。另外发现，干扰素（IFN）是bFGF的一种抑制剂，它在皮下种植瘤周围的内皮细胞和成纤维细胞中高表达，在肾脏周围的组织中却没有表达。这种因部位不同而出现的bFGF表达水平的改变主要是源于其对组织微环境的适应能力[30]。除此之外，淋巴系统对肿瘤的血管生成也有一定的影响，如T淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞等。
3.7微环境对肿瘤免疫的影响
肿瘤免疫
机体免疫系统处于功能完好的状态，对肿瘤又能作出反应，为何在大多数情况下肿瘤生长得不到有效的控制?目前资料表明[31]，抗肿瘤特异性抗体与肿瘤细胞结合，激活补体杀伤肿瘤细胞。T淋巴细胞可能通过其表面的抗原特异性受体识别肿瘤表面抗原，继而经过一系列主动耗能过程，最终导致肿瘤细胞的杀伤。抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）对肿瘤细胞杀伤效应，需要抗体Fc段与免疫细胞Fc受体结合，抗体Fab段与靶细胞结合，最终可使肿瘤细胞破坏。
巨噬细胞在机体抗肿瘤作用中起重要作用，实验证明巨噬细胞作为抗原呈递细胞启动免疫反应，并作为潜在的效应细胞介导肿瘤溶解。巨噬细胞是一种重要的免疫效应细胞，能通过ADCC效应释放细胞毒介质（TNF2α、一氧化氮等），或通过膜接触效应Fas/Fasl途径机制杀伤肿瘤细胞。在体外巨噬细胞对肿瘤不起溶解作用，但如用巨噬细胞激活因子（MAF）激活巨噬细胞即显示对细胞溶解。NK细胞杀伤靶细胞作用一般认为分四步:效应细胞识别和结合靶细胞;靶细胞刺激NK细胞因子的释放;效应细胞释放NK细胞因子;NK细胞因子结合靶细胞并引起溶解。细胞毒性T细胞（CTL）通过溶细胞作用直接杀伤肿瘤细胞，是抗肿瘤免疫中的主要效应细胞。CTL通过释放多种细胞因子和酶，如IL26、穿孔素、溶细胞素等溶解靶细胞。Fas/FasL二者相互作用是细胞凋亡的重要途径之一。细胞因子、干扰素的作用主要有:增强主要组织相溶性抗原（MHC）和肿瘤相关抗原（TAA）的表述;增强自然杀伤细胞（NK）的细胞毒作用;增强ADCC作用;直接的抗细胞增殖作用和抗血管生成作用。
在某些条件下，上述抗肿瘤免疫难以见效，如给小鼠注入的抗肿瘤抗体可预防血行乳腺细胞所造成的肺转移同样的抗体却不能抑制皮下注入相同肿瘤生长。体外培养，抗体与肿瘤细胞相结合，并激活补体系统后，能溶解分散的悬浮肿瘤细胞，对实体肿瘤并不呈出明显的破坏作用。抗体能与体外培养的肺腺癌细胞起反应，与肺腺组织基本无反应。肿瘤细胞小团块比起同样数目散在、单个细胞更易发生转移。这可能与皮下组织物质交换较慢、一定数量的实体肿瘤内及周围液体更加容出现低pH、低O2、营养贫乏状态。单抗Herceptin和人源化的嵌合抗体Rituximab的临床应用已取得了较好的疗效，但部分患者仍未能取得满意的结果[32，33]。
目前，大多数学者认为肿瘤的免疫逃逸有两方面：1.与肿瘤有关的免疫逃逸机制：缺乏抗原表位，MHC2I型抗原表达的变化，抗原丢失变异的选择，抗原调变，免疫选择或逃逸免疫防御网，缺乏共刺激信号，免疫抑制，Fas/Fasl与肿瘤免疫逃逸。2.与宿主有关的肿瘤免疫逃逸机制:免疫应答基因丢失或减弱，免疫促进、淋巴因子产生异常，免疫抑制因子，效应细胞功能异常，免疫抑制性巨噬细胞、抑制性T细胞[31]。
到目前为止，宿主肿瘤的微环境对肿瘤免疫逃逸仍未能引起足够的重视。年，作者从肿瘤微循环的特点出发，首次提出了恶性肿瘤组织内流动的血液、淋巴液、组织间液某些成分（简称肿瘤内环境），可能不是免疫因子和细胞免疫反应的最适状态，可能是构成肿瘤逃避机体抗肿瘤免疫反应的液体屏障，其低O2、低pH、低营养状态不足以为细胞免疫反应提供必需的O2和能量，也不利于免疫细胞与攻击目标的接触反应，“肿瘤内环境”是机体抗肿瘤免疫反应不能有效杀伤实体恶性肿瘤原因之一[34]。年3月作者开始首次从事实体恶性肿瘤pH值对细胞因子和免疫细胞抗恶性肿瘤影响的基础和临床研究:通过调节细胞培养液pH值，观察不同pH值状态下，LAK细胞增殖和LAK细胞、rIL22、IFN2α2b、INF2ɑ2b+ADM对恶性肿瘤细胞杀伤作用的差异。应用不同实验终浓度的rIL-2、IFN-α2b和INF2ɑ2b+ADM杀伤人肝癌细胞的试验，国内外首次发现培养液pH值为7.6时，rIL22、IFN2α2b、INF2ɑ2b+ADM杀伤效果最佳。在动物实验基础上，本课题组成员得到患者知情同意后，应用Seldinger技术穿刺股动脉，国内外首次经恶性肿瘤靶动脉灌注碳酸氢钠，明显提高了IL22、IFN2α2b和ADM介入治疗的效果[35-39]。
肿瘤的发生、发展与机体免疫功能有密切关系，当机体免疫功能低下时，易发生恶性肿瘤，恶性肿瘤的发展进一步抑制患者的免疫功能。恶性肿瘤最主要的治疗方法为放疗或化疗，由于放疗和化疗对机体免疫功能具有较强的破坏作用，因此，放疗或化疗时，把提高免疫功能作为肿瘤治疗与辅助治疗的重要手段。选择提高细胞免疫和体液免疫包括NK细胞活性，促进T辅助细胞和IL-2及IFN-γ的生成等措施，是抗放疗副作用经常采用的方法[40]。免疫治疗与其他治疗方法联合应用可减轻手术、化疗对细胞免疫的抑制，有利于患者细胞免疫功能的恢复，消灭残留的肿瘤细胞，减少复发[41]。
提高患者的免疫功能和改善体质状况对肿瘤的治疗非常重要。三氧可激活免疫活性细胞，生成多种免疫活性因子，如各种内源性干扰素（IFN-α，β，γ），白细胞介素（IL-2、4、6、8、10），肿瘤坏死因子（TFN-α），粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和转化生长因子（TGF-β1）等[42，43]。细胞因子是机体的各种细胞合成和分泌的小分子多肽类物质，多为糖蛋白：它们调节机体的生理功能，参与各种细胞的增殖、分化和行使功能；它们能诱导长期的抗肿瘤免疫或消除已形成的肿瘤。研究表明，IFN-α、IL-2、TFN-α、GM-CSF、TGF-β1等细胞因子抗肿瘤作用机制概括为：诱导免疫效应细胞的激活、增殖与分化，增强免疫效应细胞的功能与活性；抑制肿瘤病毒的增殖和肿瘤细胞的分裂；促进肿瘤细，匝抗原递呈和共刺激分子表达，从而提高机体对肿瘤细胞的识别与杀伤作用；直接杀伤肿瘤细胞或诱导肿瘤细胞的凋；抑制肿瘤血管生成，诱导肿瘤血管分化[44]。
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