赖氨酸修饰对蛋白质功能的调控

在

生命进化的长河里，作为基因产物的蛋白质演化出大量的翻译后修饰。相比原核细胞或低等动物细胞，哺乳动物细胞内蛋白质翻译后修饰受到内外微环境变化的调控更为复杂。在哺乳动物细胞中，这些修饰和去修饰是在相应酶的控制下发生的，使蛋白质处于修饰和去修饰的可逆反应中，好像阴阳两面可以此消彼长，但维持着动态平衡。因此，细胞内生化反应无不受到蛋白质修饰的调节和控制，可以说，蛋白质修饰影响和决定着蛋白质的功能和细胞的命运。修饰和去修饰的阴阳平衡被打破，可能导致机体发生一系列病理状态，包括肿瘤等重大疾病。

什么是赖氨酸修饰？

蛋白质存在着多种翻译后修饰类型，发生在各种不同的氨基酸残基上，主要包括酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸的磷酸化、半胱氨酸的氧化、脯氨酸的水解、谷氨酰胺的糖基化、精氨酸的甲基化等。在赖氨酸残基上可以发生多种修饰，包括乙酰化、甲基化、泛素化、类泛素化（包括SUMO、NEDD8等十余种），以及最近我们发现的丙酰化和丁酰化。赖氨酸侧链的ε-NH3+被乙酰化后转变为ε-NH-COCH3，从而中和了其正电荷；而加上泛素蛋白或SUMO蛋白分子后不仅中和了正电荷，还相当于长出了枝杈。

赖氨酸修饰为什么重要？

乙酰化、泛素化、SUMO化，以及丙酰化和丁酰化的一个共同特点是中和了赖氨酸侧链的正电荷，从而改变了被修饰蛋白质的带电性，其中被泛素和SUMO修饰还改变了被修饰蛋白质与其他生物大分子相互作用的界面，其结果是调节了被修饰蛋白质对DNA、蛋白质、质膜或内膜的亲和性，进而改变被修饰蛋白质的亚细胞定位或活性，使蛋白质的功能也发生改变。比如，如果被修饰的蛋白质是酶，它的修饰状态可以影响到它在什么地方遇到什么底物，也可以影响到它活性的有无和高低。可以想见，赖氨酸残基的修饰在蛋白质功能的调控中占据重要的地位。

长期以来，酪氨酸磷酸化介导的分子开关效应被认为是解释细胞信号转导如何发生的最重要机制。酪氨酸磷酸化曾经几乎就是信号转导的代名词。然而，我们团队成员在世界上率先报道了基于赖氨酸乙酰化的膜蛋白受体激活，提出了赖氨酸乙酰化调控信号转导的理论。这也是国家计划项目“赖氨酸翻译后修饰及对蛋白质功能的调控作用”开展的重要基础。

◇◇◇

本

项目以肿瘤发生发展过程中几个重要生长因子、细胞因子/趋化因子的信号通路为主线来展开，阐明乙酰化、泛素化、SUMO化等赖氨酸修饰在其信号通路中的动态变化及规律，并探讨基于对这些修饰的认识在肿瘤临床实践中应用的可能性。主要研究内容（见图1和图2）包括：

肿瘤发生发展过程中膜蛋白赖氨酸修饰的作用与信号调控网络。我们系统地挖掘肿瘤细胞中一些生长因子和细胞因子/趋化因子诱导发生乙酰化修饰的膜蛋白及动态变化过程，鉴定调控这些膜蛋白乙酰化修饰的乙酰基转移酶和去乙酰化蛋白酶及其信号网络，并阐明在肿瘤发生发展中的作用与意义。

肿瘤发生发展过程中细胞核蛋白赖氨酸修饰的作用与信号网络。我们系统地探讨与肿瘤发生发展密切相关的一些生长因子、细胞因子/趋化因子的信号通路中细胞核蛋白质的的泛素化、SUMO化及乙酰化的动态变化以及不同修饰之间相互作用的模式，揭示参与调控这些修饰的修饰酶的相应变化，从而阐明以这些修饰酶及发生赖氨酸修饰的靶蛋白质为核心的信号网络以及它们在肿瘤发生发展中的作用。

基于蛋白质赖氨酸修饰的肿瘤标志物鉴定与检测方法。我们在基于质谱的蛋白质组学技术的基础上建立各种赖氨酸修饰（包括丁酰化等新修饰）的分析方法，对赖氨酸修饰的靶蛋白及修饰的动态变化进行观察，确定一些可作为肿瘤标志物的修饰，并发展相应的抗特异性赖氨酸修饰蛋白肽段的抗体以及基于抗体的诊断方法。

基于赖氨酸修饰相关的肿瘤治疗靶标鉴定及先导化合物筛选。通过采用基于结构生物学和化学生物学等原理设计的高通量筛选策略，来发现、优化设计具有干扰靶标蛋白质活性的先导化合物，并进一步就其药理效应以及作用机制开展深入的研究。

◇◇◇

项目获得了多项成果

发现了多个赖氨酸修饰和去修饰酶在炎症和肿瘤中的作用及其机制

Toll样受体（TLR4）参与生物体的先天性免疫反应和炎症反应,帮助先天免疫细胞识别微生物病原体，并引发适当的免疫反应。TLR4胞内结构域（TIR）招募MAL和MyD88从而激活NF-kB转录因子，招募TRIF和TRAM从而激活IRF3转录因子。长期以来，TLR4如何分别调节控制这两条通路还是不得而知。我们激动地发现，TLR4原来是依靠诱导其胞内结构域TIR的乙酰化来完成的。TIR区域的K4乙酰化是招募激活Mal/MyD88所需要的，而K8乙酰化则是招募激活TRIF/TRAM所需要的。这样在不同赖氨酸残基上的特异性乙酰化，使这两条通路有很好的分叉控制。进一步的实验发现TLR4的乙酰化和巨噬细胞的微生物吞噬有正相关作用。

更令人激动的是，我们发现赖氨酸氧化酶其实是一组去乙酰化和去氨乙酰化酶。由此首次提出，哺乳动物细胞除了拥有目前认识到的HDAC和SIRT两大类去乙酰化酶之外，还有LOX这套全新的去乙酰化酶。赖氨酸氧化酶N末端带有信号肽，具有引导穿膜或者分泌作用。但是我们发现，在生殖系统肿瘤细胞里，LOXL2和LOXL3丢失信号肽，失去分泌和挂膜作用，转而进入细胞核。LOXL2在细胞核中调节组蛋白H3K36的去乙酰化和去氨乙酰化，而LOXL3则负责STAT3的去乙酰化和去氨乙酰化。由于STAT3被IL-6激活，促进CD4+Th0细胞分化成CD4+Th17细胞，因此在LOXL-/-小鼠中，STAT3被持续性乙酰化激活。IL-6诱导的Th17细胞分化比野生型小鼠倍增，肠道DSS诱导肠炎变得更加严重（相关研究成果发表于《分子细胞》）。LOXL2在大量子宫癌中发生缺失性突变或降低表达。我们发现，LOXL2主要作用在H3K36位点的去乙酰化。CHIP-SEQ结果表明，LOXL2通过诱导H3K36的去乙酰化修饰，导致细胞周期的一些促进因子的表达大大下降。HeLa细胞稳定过表达LOXL2的成瘤实验表明其抑制成瘤性。于是，我们将小鼠的LOXL2敲除后发现H3K36乙酰化大大增加了，并且几乎%的雌性小鼠发生了子宫肥大，其中10%的小鼠自发子宫癌。而雄性小鼠发生了脂肪瘤、附睾肥大，其中10%的小鼠自发阴茎癌。这些发现有助于解释临床上子宫癌和阴茎癌的发病机制，也可能用于帮助诊断。

CUL4B属于Cullin家族，该家族成员作为骨架蛋白参与构成最大的一类泛酸连接酶（Cullin-RingE3ligases,CRL)。由CUL4B构成的泛素连接酶复合物简称CRL4B，催化众多核内蛋白质的泛素化。本项目中我们系统地分析了CRL4B如何通过调控蛋白质泛素化而在肿瘤发生发展中发挥促进作用，发现了多个肿瘤相关的CRL4B作用靶分子和信号通路。主要有：CRL4B通过单泛素化组蛋白H2AK，进而招募和稳定转录抑制复合物PRC2，而抑制包括p16、PTEN等在内的一组抑癌基因转录，从而促进食管癌发生发展（相关研究结果发表在《癌细胞》）；通过协同SUV39H1/HP1/DNMT3A复合物发挥作用，通过改变DNA甲基化水平进而抑制多种抑癌基因基因表达，在宫颈癌发生发展中发挥重要作用；通过激活Wnt/beta-catenin通路而在肝癌发生中发挥重要作用，是通过抑制Wnt通路拮抗因子转录而实现的；协同Sin3a/HDAC复合物而转录抑制抑癌基因p21，促进细胞增殖；通过调控AKT/beta-catenin通路而限制髓源抑制细胞（MDSC）积累，在肿瘤微环境调控中发挥重要作用。

SUMO化是类似泛素的小蛋白修饰。催化SUMO化修饰的逆向反应的是一个蛋白酶家族，叫作SENPs。我们延续课题组原有传统，对其家族成员SENP1和SENP3进行了系统的研究，发现了一系列与炎症、肿瘤有关的底物、信号通路和细胞效应。我们制备了SENP1和SENP3在巨噬细胞特异性敲除的小鼠。我们发现在SENP1突变的巨噬细胞中，PTP1B发生了高度SUMO化修饰，SUMO修饰抑制了PTP1B磷酸酶活性，因此，Stat3发生过度活化，并通过Socs3抑制IFN-g信号通路的活性以及巨噬细胞的活化。因此我们认为SENP1通过改变STAT3和STAT1的平衡成为一个巨噬细胞极性的重要调控因子。利用这个特异性敲除SENP1的小鼠（SENP1CKO小鼠）建立结肠炎-结肠癌肿瘤模型，我们发现SENP1CKO小鼠的肿瘤发生率显著低于SENP1WT小鼠。但是在使用DSS诱导结肠炎症的过程中，SENP1CKO小鼠腹泻和死亡率显著高于SENP1WT小鼠。进一步发现，DSS刺激后CKO小鼠肠壁炎症细胞（CD45+cells）数量显著高于WT小鼠，但是具有抑制肿瘤免疫的MDSC细胞的数量却显著低于WT细胞，表明SENP1缺陷的巨噬细胞表现为抑制结肠癌的发生。而在SENP3缺失的巨噬细胞中，激酶MKK7的SUMO化程度增强，这一修饰抑制了该激酶对JNK的磷酸化激活，在内毒素脂多糖LPS引起的炎症模型中，巨噬细胞炎症应答反应减弱，小鼠的内毒素休克死亡率也降低，说明SENP3有促进炎症的作用。我们发现SENP3对胃癌有促进作用。一是能促进转录因子Sp1的稳定，其作用通过影响SUMO依赖的泛素化修饰实现；二是能促进胃癌上皮-间质转化（EMT），与胃癌的淋巴结和肝脏的相关，因SENP3能通过去除SUMO修饰而促进新认定的EMT转录因子FoxC2的活性，增强EMT，这在病人转移性胃癌以及裸鼠移植瘤从胃转移至淋巴结和肝转移模型中得到验证。我们还发现在喉癌细胞中应答炎症因子促进恶性转化和肿瘤细胞恶性表型的转录因子Stat3存在SUMO化修饰，主要效应是促进Stat3与其磷酸酶TC45结合，因而有限制Stat3活化的作用。而烟草成分NNK能通过诱导SENP3增多而促进Stat3去除SUMO，从而阻抑TC45的去磷酸化效应，促进了Stat3的高磷酸化状态。这一过程在多株头颈部肿瘤细胞系存在。这是吸烟促进头颈部肿瘤发生发展的一种新机制。我们还在多例喉癌标本中观察到SENP3与磷酸化STAT3水平的高度相关性及其与吸烟和临床病理分期等指标之间的高度相关性。据此，胃癌和喉癌手术切除组织中SENP3的表达水平可以用于肿瘤预后判断。

十分有趣的是，我们还发现了SUMO化和乙酰化这两种赖氨酸修饰的关联。Sirt家族是去乙酰化酶家族。我们观察到SUMO修饰能够特异地调控Sirt6去除H3K56乙酰化活性以及与此相关的Sirt6肿瘤抑制功能。

泛素连接酶HACE1具有非常强的肿瘤抑制活性。HACE1敲除小鼠的几乎每一个组织都有极高的自发肿瘤发生；在人类多种肿瘤中HACE1基因因突变、缺失或其启动子被甲基化而普遍下调。我们在实验室构建的HACE1条件性敲除小鼠细胞和动物模型的基础上，通过酵母双杂交以及蛋白质组学方法鉴定具抑癌活性的泛素连接酶HACE1的底物或相互作用蛋白，发现了HACE1抑制肿瘤以及HACE1下调促进肿瘤特别是肝癌发生发展的分子机制。

我们发现了多个与乳腺癌发生发展相关的泛素连接酶和去泛素酶，并阐明了它们的作用机制。E3泛素连接酶HECTD3是一个研究非常少的新的泛素连接酶，它在肿瘤中的表达模式、功能和机制都是未知的。我们的研究首次发现HECTD3高表达在乳腺癌，与肿瘤级别以及病人存活呈现负相关。因此HECTD3表达有望作为乳腺癌诊断和预后标志物。我们首次发现抑制HECTD3表达能让癌细胞对顺铂、紫杉醇以及放射治疗更加敏感。其机制是HECTD3泛素化修饰MALT1，HECTD3至少部分通过稳定MALT1来促进癌细胞存活。这些结果为克服癌症治疗抗性提供了新的治疗策略。与此同时，我们研究发现HECTD3阻止caspase-8进行活化，最终促使癌细胞免于凋亡。我们筛选鉴定出一个全新的具有癌蛋白性质的E3泛素连接酶RNF，发现它在ER阴性乳腺癌过表达并促进多种癌细胞增殖，其作用机制是泛素化p21导致后者蛋白降解，从而促进细胞周期。相关研究成果于年发表在《癌症研究》，是国际上第一篇完整报道RNF功能和机制的科研论文。

去泛素化酶BAP1是一个在多种癌症中频繁突变的基因，但是其作用机制不清楚。我们首次发现它增加KLF5稳定性。这种作用是通过BAP1对KLF5的去泛素化来实现的。敲低BAP1或者KLF5表达都会抑制三阴性乳腺癌细胞在裸鼠体内生长和肺转移。这项研究首次阐明BAP1在乳腺癌中的促癌功能和作用机制，为三阴性乳腺癌的治疗提供了新的靶点。

开发了一系列赖氨酸修饰组学检测技术方法，并研发了若干靶向肿瘤标志物的赖氨酸修饰酶类的化合物

我们按照计划开发了多项赖氨酸修饰组学检测技术方法并应用于肿瘤样品分析。采用定量蛋白质组学技术鉴定了高、低侵袭性食管癌细胞组蛋白的翻译后修饰图谱，研究了赖氨酸丁酰化等新修饰的分布规律；发现了H4K79上的赖氨酸二甲基化修饰在两种细胞系中具有显著的差异性；通过生化技术验证了这一差异性修饰的可靠性，并通过食管癌病人组织样本的筛选分析，发现了这一差异性修饰与肿瘤病人5年成活率相关。这一研究的结果，不仅为食管癌研究提供了潜在的生物标志物，也展示了我们的分析方法在鉴定肿瘤特征分子中的潜在价值。我们构建了一种基于DNA自组装和亲和光交联的二元探针，发展了组蛋白修饰识别蛋白分析新方法。这一方法既能保障组蛋白修饰与结合蛋白特异性识别和作用，也能将识别蛋白共价键合到探针上，可以提高富集效果。基于上述策略，我们实现了组蛋白H3K4me3对其作用蛋白结构域PHD的高选择性标记和富集。在细胞核裂解液中鉴定到包括BPTF在内的很多已知识别的蛋白，同时还发现了一些未见报道但具有识别结构域的蛋白。我们建立了赖氨酸乙酰化修饰组大规模分析的新方法，在大肠杆菌中发现了0多个乙酰化位点，其中包含大量未见报道的修饰位点，将原来报道的乙酰化蛋白和修饰位点的数量分别扩展了3倍和8倍（相关研究成果发表在《蛋白质组学》）。这一工作显著提高了蛋白乙酰化的鉴定水平，拓展了蛋白乙酰化的数量，揭示了乙酰化的分布规律和特征，为相关的生物医学研究提供了数据，受到广泛







































控制白斑发展
白癜风专业医院资讯网

转载请注明：http://www.nwsaj.com/zljcl/8127.html