确定原始的美国PED病毒PC22A毒株的
致病病原PED病毒是年被鉴定的。之后，PED在欧洲各国出现大流行并造成猪的死亡，直到年代末。之后，PED病毒在欧洲更多呈地方性发病。
在亚洲，大流行造成哺乳仔猪大量损失的事件初次见报是在年，持续到-年代。
从年10月以来，中国报导了多次严重的PED大流行暴发，感染所有日龄的猪只，但典型情况下哺乳仔猪的死亡率会很高，造成严重的经济损失。
年4月PED病毒出现在美国的猪群里，并在该国全境迅速扩张，导致-年万头猪死亡，并造成9-18亿美元的经济损失。
采用剖宫产初乳剥夺（CDCD）限菌猪和常规猪对原始美国PED病毒分离株的致病机理进行了研究。
与现场观察相符，原始美国PED分离株为高度致病，在哺乳仔猪当中造成%的发病率和50-%的死亡率。
在某些猪场，通过回喂粪便材料和/或感染仔猪的肠道组织故意让妊娠母猪接触病毒，可刺激母源免疫，并缩短了暴发周期。然而，PED病毒的暴发仍然在美国持续。迫切需要有效的疫苗用来预防PED。
为了评估疫苗的活体效果，就需要采用标准化的、有效的PED病毒对来自免疫母猪的仔猪进行攻毒。截至目前，需要获得关于合并PED病毒挑战的感染滴度、以及标准PED病毒接种规程的信息才能评估PED病毒疫苗的药效。
在本研究当中，通过4日龄CDCD仔猪对原始美国PED毒株PC22A的猪腹泻中位剂量（PDD50）进行了确定。同时，对急性临床症状和病例损伤进行了研究。动物的使用规程经过了俄州大“农业动物护理与使用委员会”的审查和批准。
找到了四头所在猪群无先前PED暴发史、并且PED病毒血清学检测（明尼苏达大学兽医诊断实验室）结果阴性的PED幼稚经产母猪（A、B、C、D）。
对她们进行剖宫产，以便获得CDCD猪（n=53）。出生当天给仔猪饲喂牛初乳替代品，此后在第三天之内逐渐替换为全奶。
整个试验期间按兽医处方使用了抗生素（青霉素、庆大霉素和新霉素）、抗毒素（梭菌抗毒素）和益生菌以便防止仔猪的机会病原感染。
所有仔猪随机分配到8个剂量组（G1-G8）当中，以及两个安慰剂对照组（表1）。每头仔猪养在单个钢笼里，同组猪养在地上3层猪笼里（每层2-4笼）。猪笼房间为生物学安全级别II级（BSL2）。相邻两个剂量组的猪养在同一房间的不同侧（5.4?×?3.0m2）。
表1.猪分组和对应编号、接种物以及接种后猪的腹泻结果
a每头猪口服接种3mL接种物。
b滴度根据原始病毒合并样本滴度和稀释倍数计算。
cG1-G8和对照组以及常规的E母猪组接种后24小时，以及常规母猪F和G组接种后7至9天，粪便评分分别确定为3分。
dRT-qPCR阴性或低于量限(4.8log10GE/mL).
e10头猪数据，检测为阳性。
f2头猪数据，检测为阳性。
g对照1组仔猪，与G5仔猪养在同一栋猪舍。
在一头限菌（Gn）猪体内制备PEDVPC22A毒株的病毒池，制备过程在我们的先前研究中有描述。对组织培养驯化PC22A第二代继代（P2）进行蚀斑纯化，选出一个蚀斑在Vero（绿猴肾）细胞中做进一步扩增（总共P3）。它被用作接种物（5log10蚀斑-形成单元[PFU]/ml），对一头19日龄Gn猪进行口服攻毒。
接种1天之后（1dpi），当它表现水样下痢的时候，将这头猪安乐死。采集该仔猪的小肠和大肠内容物，混合并在?80℃条件下保存在1ml容积的试剂管中作为病毒池。
如报告采用蚀斑分析和定量实时逆转录-PCR（RT-qPCR）进行检测，该病毒池的感染滴度和RNA滴度分别为7.75log10PFU/mL和13log10基因组当量(GE)/mL。
猪的接种物制备方面，采用1ml的PC22A病毒池，采用磷酸缓冲盐1:10稀释，混合均匀。悬浮液在4℃条件下?×?g下离心10分钟，取上清液作为1:10(10?1)稀释液。之后，在PBS中进行10倍序列稀释（10?2-10?10）。
4日龄上，每个试验组（G1-G8）仔猪口服接种3ml的10倍序列稀释(10?3-10?10)病毒。对照组接受PBS（表1）。
接种之后，每天4次观察仔猪临床症状，包括腹泻。每天对所有仔猪采集直肠涂样，并对粪粘稠度进行评估：0?=?正常;1?=?糊状;2?=?半液态;and3?=?液态。评分为3分即视为水样下痢。
确定了猪中位腹泻剂量（PDD50），方法是用Reed-Muench法计算给定时间内一半以上仔猪出现水样下痢的病毒稀释倍数。
为了降低猪之间交叉污染的风险，PEDVPC22A接种的CDCD仔猪一出现水样下痢就被安乐死，并实施尸检。取十二指肠、控场、回肠、盲肠、结肠和肠系膜淋巴结，如前述固定在10%中性缓冲福尔马林溶液中留作组织病理学检查。
对每段空肠，用计算机图像系统对10个茸毛和隐窝进行测量。计算了茸毛高度和隐窝深度比（VH:CD）。
同时，通过免疫组化试验，采用鼠单克隆抗体（SD6-29）对PED病毒核壳体（N）蛋白进行了检测。
因为常规哺乳仔猪是未来疫苗研究的目标，所以选择了PED病毒幼稚经产母猪E，并且给她自然分娩的哺乳仔猪4日龄口服接种PC22A，每头仔猪PDD50，以便验证CDCD猪试验的结果。
此外，从最近暴发(年7月19日)过PED的猪场获得两头接触过病毒并且已经康复的经产母猪F和G，在产前73至75天连续3天（年7月20-22日）暴露接触活病毒。通过PED病毒特异性细胞培养免疫荧光试验（CCIF）和空斑病毒中和（PRVN）试验对F和G母猪进行检测，方法如描述，二者PED病毒特异抗体IgG、IgA和病毒中和抗体在暴发后53天（产前22-23天）均为阳性。
F和G母猪通过自然分娩分别产出13和10头仔猪。仔猪和它们的母猪在单独的房间里养在一起。4日龄的时候，分别给F和G母猪的仔猪口服接种00PDD50和0PDD50。分别在7dpi和9dpi，对仔猪和它们的母猪实施安乐死。
表2.现场条件下接暴露触过PED病毒的母猪F和G的血清和乳汁样本中特异性IgG、IgA和病毒中和（VN）抗体水平
a母猪F和G的血清分别于分娩前20-22天和接种后7至9天采集。母猪F和G的仔猪分别于4日龄按00和0PDD50接种。母猪F和G的乳样于接种后1天采集。
bNA:不适用。
在病毒接种之前，直肠涂样或肠溶物的猪流行性腹泻病毒RNA粪中排毒为阴性，并且对G1-G6CDCD仔猪（10?3-10?8稀释病毒），在1dpi转为阳性，滴度范围9.8-13.7log10GE/mL（表1）。
到1dpi时，G1至G5当中%仔猪表现下痢，G6仔猪40%（2/5）下痢，G7和G8（10?9and10?10稀释病毒）和对照组1、2无下痢。对照组1的2头仔猪与G5（10?7稀释病毒）仔猪养在同一房间。它们在1dpi时临床表现健康，但2dpi上表现水样腹泻。
对照1组的两头猪分别于1和2dpi排出病毒RNA。这些结果显示，在同屋这两组（G5和对照1）仔猪之间发生了PED病毒的交叉感染。
确定PDD50的时间分界点设定为1dpi，检测结果为7.83PDD50/3mL，对应于7.35log10PDD50/mL。它和通过蚀斑试验确定的细胞培养感染滴度（7.75PFU/mL）相似。对照组2的两头仔猪在3dpi上未观察到临床症状，也未检到PED病毒RNA排毒。
显微方面，接受相同病毒剂量的同组CDCD仔猪之间在1-3dpi表现了不同阶段的茸毛萎缩（图1A-D）。在某些仔猪当中，茸毛略有缩短，但茸毛上皮细胞的外形总体完整（图1A-B）。
在另一些情况下，茸毛显著缩短，伴有肠细胞脱落和空泡（图1C）。随着茸毛萎缩趋于严重，整个小肠的茸毛变钝并融合（图1D）。
然而，在接受不同PED病毒抗原剂量的各组当中，茸毛萎缩的程度无显著差异。
总体上，大部分（40/49，82%）PED病毒接种CDCED仔猪的平均空肠VH:CD比值都2。相比之下，对照组2的两头对照仔猪的平均空肠VH:CD比值分别为7.16?±?1.25和7.80?±?0.60。
图1.采用鼠康PED病毒核壳体单克隆抗体(SD6-29)进行的免疫组化（IHC）染色来检测PEDVPC22A感染。
PED病毒抗原的指示为棕色，在PEDVPC22A接种CDCD仔猪（A-D）空肠中段的全部茸毛上皮细胞中都检测到。观察到茸毛变短和融合，伴有肠细胞脱落（C、D）。取决于PED病毒感染的进展，感染了PED病毒的茸毛上皮细胞会仍然构成茸毛（B）、脱落、肿大或经历坏死（C），或高度弱化（D）。在从CDCD（E）和常规（F）蜘蛛获得的回肠当中，PED病毒抗原扩展到茸毛/隐窝边界，并且散步在隐窝细胞层（CCL）。大部分残留上皮细胞为PEDV阳性。此外，从来自PED暴露并恢复的母猪（G）的常规PED病毒接种仔猪获得的控场穹顶区的很少的单核细胞中检到了PED病毒抗原。在安慰剂接种CDCD仔猪（H）的空肠中未见到PED病毒抗原。原始放大倍数：×40(A),×(B-H)。
在来自对照2组的2头仔猪的组织当中，通过IHC（图1H）未检到PEDVN蛋白。然而，对于PEDV接种猪，整个小肠均呈PEDVN蛋白阳性，主要在茸毛尖端和侧壁上、直到茸毛/隐窝边界处的肠细胞的胞浆里检测到（图1A-B）。
较少情况下，在李氏肠腺隐窝的里面或附近也观察到PEDV阳性细胞（5/49，10%）（图1A-B）。有些情况下在VH:CD比相对较高（2.54至5.17）的情况下会检到最密集的IHC指示（图1A-C）。随着茸毛萎缩的加重，茸毛上皮细胞总数和PEDV阳性细胞数会急剧减少（图1D）。在6/49（12%）PEDV接种CDCD猪（数据未展示）的结肠上皮当中检到散发PEDV抗原病灶。
PED幼稚母猪E的那12头仔猪在1dpi上表现了水样下痢，以及高水平的PED病毒RNA排毒（11.8-13.0log10GE/mL）。1至5dpi之间死亡或安乐死的仔猪的VH:CD平均比值在0.48?±?0.12至1.57?±?0.32之间，除了5dpi安乐死的一头仔猪表现了相对较高的VH:CD平均比值（2.29?±?0.64）。
PED病毒抗原分布的规律与CDCD仔猪中观察到的类似（数据未展示）。注意到一头5dpi安乐死的常规仔猪（1/8）隐窝上皮细胞退化，含有大量PEDVN抗原。
F和G母猪的仔猪7dpi和9dpi未表现下痢。F(3/13,23%)和G(8/10,80%)母猪的部分仔猪粪中没有排毒，其它仔猪有排毒，滴度较低（4.9-8.9log10GE/mL）（表1）。
安乐死时（7或9dpi）采集的F和G母猪的血清样本的PEDV特异性抗体滴度和产前滴度相似，符合母猪由于仔猪保护而缺乏PED重新刺激的情况（表2）。1dpi采集的F和G母猪的乳样PEDV特异性抗体滴度（F母猪IgG，IgA，VN；G母猪IgG，IgA，VN）比血清样本高得多（表2）。
在7或9dpi上，F和G母猪的仔猪当中未观察到显著的组织病理学损伤。在场粘膜下层/集合淋巴结的个别单核细胞当中检到PEDVN蛋白，但肠茸毛上皮细胞中未检到（图1G）。
来源/ThePigSite
翻译：温鹏
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