最新8分加SCI研究套路疾病百搭的三元
上周五的第24期《文献品谈会》Ione师姐选择了一篇三元一组交互文献案例，更贴心的是它是一篇你们喜欢的非肿瘤研究领域文章。它发表在cellreports（IF：8.）上，研究方向为炎性肠病。
一、总览结合标题、摘要和机制图，可以推测本文的科学假设：SIAH2泛素化修饰调节SENP7激活γδT细胞介导肠道炎症。（三元一组直接机制+泛素化修饰）总结文章要素：
主变量：SENP7
交互变量：SIAH2
下游变量：γδT细胞
表型：炎症
疾病：炎性肠病IBD
从图中的模式图我们可以整理文章思路：可以分为两种情况
在健康的肠上皮细胞中：SIAH2通过泛素化降解SENP7，阻断SENP7激活后的一系列效应。
在炎性肠上皮细胞中：SIAH2低表达不能降解SENP7，高表达SENP7进一步去苏木化修饰相关蛋白，激活上皮细胞炎症通路，释放IL-15进一步激活γδT细胞，促进炎性肠病的进展。
二、研究背景：
1.炎性肠病（IBD）是一类原因不明的肠道自身免疫性疾病的总称。肠道上皮细胞（IECs)与肠道淋巴细胞（IELs）的交互对肠道内稳态至关重要。
2.TCRγδ淋巴细胞是一类表面受体TCRγδ阳性的T细胞，可产生多种细胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL-17A等）。TCRgd淋巴细胞在IBD中的功能目前尚有争议。
3.SUMOylation是一种可逆性蛋白翻译后修饰，又称为苏木化或者类泛素化。SUMO家族的SUMO1或SUMO2、SUMO3在一系列酶的作用下连接于底物蛋白质,改变其功能或与其他蛋白质的相互作用。
4.SENP是一种去苏木化酶（包括SENP1、SENP2...SENP6、SENP7），在炎症的级联反应中有重要作用，已经发现SENP6基因敲低的动物对内毒素休克的敏感性增加。SENP7在IBD中的功能尚未知。
三、结果解读：
1.去苏木化酶SENP7在肠炎中的表达上调————SENP7表达差异
A：DSS处理诱导肠炎小鼠模型，SENP7在肠炎模型鼠中的表达增加，检测的为整个结肠组织
B：检测的脾脏组织，SENP7肠炎模型鼠和对照鼠中的表达差异不明显
C：检测的结肠组织，免疫组化显示SENP7在肠炎模型鼠中的表达增加
D：从小鼠肠中分离肠上皮细胞，检测SENP7在肠炎的肠上皮细胞中表达增加
E：检测的临床组织标本，UC指的是溃疡性结肠炎，CD指的是克罗恩病，与正常对照相比，UC和CD众的SENP7表达上调
F：相比于正常对照，在肠炎中即UC和CD组中的游离SUMO2/3增加。（苏木化是SUMO2/3连接到底物蛋白上对底物蛋白进行修饰），F图检测肠炎组织中的游离SUMO2/3增加，说明肠炎组织中的苏木化修饰下降。
整个图1从细胞、动物、组织水平三个角度说明SENP7在炎症肠病中的表达是上调的
2.SENP7在炎症结肠组织中的异常表达是泛素连接酶SIAH2介导的————SENP7的上游变量+调节机制（泛素化修饰）
图1说明了SENP7在炎性肠病中异常表达，那么是什么引起的SENP7上调呢？
作者首先分析了SENP7的一级结构，发现SENP7有一个特殊的基序，这个基序常常代表着该蛋白可以作为泛素连接E3酶——SIAH2的底物，而且SENP7的这个基序在物种之间具有很高的保守性，说明这个基序有重要的功能。
A：红框标出了SENP7的基序在多个物种间的模式图，具有很高的保守性。
B：CoIP实验，在对照组中可以看到SIAH2和SENP7之间有很强的结合，而在DSS处理组中，这种强结合消失。
为了进一步探索图A中标出的SENP7保守性基序在SENP1与SIAH2之间互作的重要性，作者进一步构建了两个基序突变体，SENP7-MUT1和SENP7-MUT2
C：与对照相比，两个基序突变的SENP7与SIAH2之间的结合都减弱了，图中的条带明显变浅，说明SENP7与SIAH2之间互作依赖于A图中预测的基序————trancation
D：免疫荧光检测蛋白共定位，突变基序后，SENP7与SIAH2之间的共定位减弱————共定位
EFG：DSS诱导的肠炎小鼠的SIAH2表达明显降低
H：随着DSS处理时间延长，SIAH2表达逐渐降低，SENP7表达逐渐增加，两个蛋白表达呈负相关
前面已经提到SIAH2属于泛素连接酶，图2的A-D说明SIAH2与SENP7之间直接结合，图2H说明SIAH2与SENP7之间的表达负相关，那么SIAH2是否是通过泛素化来影响SENP7的表达呢？
I：左边的这块胶，与对照组相比，DSS组诱导组的泛素化SENP7（即Ub-SENP7）在大分子处和小分子处的泛素化均降低
为了确定是否通过SIAH2泛素化SENP7，作者构建了过表达SIAH2-WT，以及丧失了泛素化功能的SIAH2-RM（RM表示SIAH2的泛素结构RING发生突变）
J：SIAH2-RM对SENP7的表达没有明显的抑制，但SIAH2-WT明显抑制了SENP7的表达，且该效应可以被蛋白酶体抑制剂MG所抵消————泛素化检测实验之一：MG处理
KL：SIAH2在UC（溃疡性结肠炎）和CD（克罗恩病）中的表达下调
M：在UC和CD中，SIAH2与SENP7的直接结合降低
N：在UC和CD中，SIAH2与SENP7的表达负相关
3.在炎症组织中，SENP7的互作蛋白谱改变————SENP7下游调节γδT细胞（SENP7通过IL15诱导γδT细胞）
AB：作者用SENP7的特异性抗体沉淀了SENP7并质谱分析互作蛋白成分用维恩图形式表示
C：与对照组相比，DSS组蛋白富集的通路
D：SENP7的PPI蛋白互作图，及其互作的hub基因包括：SIAH2，这个预测的结果与图2中的一致。
基于以上结果，作者推测肠上皮中SIAH2-SENP7相互作用的失调是免疫调节所必需的缓解，于是作者进一步构建了肠上皮细胞与免疫细胞共培养系统。
E：底部孔中生长的鼠结肠上皮细胞（CT26）和在上部孔中生长的免疫细胞（来自小鼠肠系膜淋巴结[MLN]）进行了共培养实验，然后流式分析T细胞的比例以及ELISA分析细胞因子
F：过表达SENP7时，γδT细胞比例明显升高，而突变SENP7时的γδ细胞比例下降
G：过表达SENP7时，IFN-g，TNF-a和IL-15显着增加
4：体内抑制SENP7可以缓解DSS诱导的肠炎————抑制SENP7缓解肠炎（表型，invivo）
A：由于直接动物敲除SENP7不可行，作者建立了利用特定基因工具抑制SENP7模式图
B：C-MO表示阴性对照组，Mo-S7KD表示SENP7敲除鼠，C-MO或Mo-SENP7KD的治疗未导致动物体重减轻或任何其他可识别的变化，说明基因工具没有明显毒性
C：抑制SENP7可以缓解小鼠的结肠长度，反映在抑制DSS诱导的SENP7小鼠长度增加
D：Mo-SENP7敲除的小鼠结肠上皮中，SENP7表达明显下降，证实了基因确实敲低；SIAH2的表达在DSS组中表达下降；DSS组苏木化水平降低；与DSS组相比，DSS+SENP7敲除组中的游离话SUMO2/3被部分抑制，而共轭SUMO2/3部分增加。
E：脾脏中的SENP7的表达趋势与肠道中的类似，DSS+SENP7敲除组中的SENP7表达下降
F：HE染色，上皮破坏，隐窝脓肿和炎症细胞浸润在敲除SENP7后好转
GHIJKL：ELISA分析炎症因子分泌的水平，促炎因子的表达水平与C图、F图趋势一致：共同说明：SENP7的敲除缓解了DSS诱导的炎症
MN：与DSS组相比，DSS+SENP7敲除组的淋巴结和脾脏中的γδT细胞数量减少
5：γδT细胞耗竭可预防DSS诱发的结肠炎————γδT细胞耗竭缓解肠炎（γδT细胞的表型）
A：用γδT细胞的中和抗体耗竭T细胞的动物造模模式图
B：与DSS组相比，DSS+耗竭γδT细胞组可以缓解小鼠的体重降低速度
CE：与DSS组相比，DSS+耗竭γδT细胞组可以缓解小鼠的结肠炎症
D：SIAH2和SENP7在各组中的表达趋势，成相反的趋势
FI：γδT细胞在DSS组中表达高，在DSS+耗竭γδT细胞组中表达低
GH：炎症细胞因子的表达水平，与γδT细胞的表达水平一致
6：SENP7过表达触发γδT细胞活化，导致促炎性信号传导
A：上皮细胞+淋巴细胞培养体系的模式图
BCDF：主要
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