25个癌种例中国晚期实体瘤样本的

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本研究数据抽样自臻和科技“臻联”系统，样本来源于在臻和科技进行“百适博”、“派蒂万”、“朗蒂思”检测的送检样本，共包括个中国人群的晚期实体肿瘤样本，涉及25个肿瘤类型，这是目前为止“样本量最大的——研究中国晚期实体瘤的——PD-L1表达和TMB水平”的研究。研究成果发表于”ExperimentalHematologyOncology”IF:3.

很高兴邀请到哈尔滨医院杨宇教授对本研究进行解读。

杨宇教授导读

已有研究发现，在某些实体肿瘤（食管癌、肝细胞癌、胃或胃食管交界腺癌）的免疫治疗中，中国患者/亚裔患者显示出了优势，他们使用免疫治疗（免疫检查点抑制剂，ICIs）会取得更好的疗效，而导致这个优势的原因并未被阐明；PD-L1表达和肿瘤突变负荷（TMB）是被最广泛应用的免疫治疗生物标志物，二者在不同癌种、不同地区患者人群的表达频率都存在很大差异，二者之间的相关性也有待进一步探索。所以基于中国人群的大样本数据分析，在未来指导中国实体瘤患者的免疫治疗实践和临床试验设计方面，或许能给我们更有价值的提示。

基于本研究的关键结果在不同肿瘤类型中，PD-L1表达水平和肿瘤突变负荷（TMB）差异很大，并且在大多数肿瘤类型中，二者之间的相关性不显著；基于本研究的所有样本，二者只显示出很小的相关性(SpearmanR=0.)。基于所有样本，PD-1+Tils浸润与PD-L1表达呈正相关(SpearmanR=0.)；而PD-1+Tils浸润与TMB无相关性。在非小细胞肺癌（NSCLC）样本中，CD8+T细胞浸润与PD-1+Tils浸润和PD-L1表达相关，而与TMB无关(SpearmanR=0.,0.,0.)。提示Tils浸润和TMB反映的免疫状态并不一样，是不同的免疫标记物。接受抗PD-1治疗，且对治疗有反应的患者（CR/PR组），他们的PD-L1表达、TMB、PD-1+Tils、CD8+T细胞浸润水平较高，且大多数患者表现出两种或者多种生物标志物水平同时升高的现象。而对治疗没有反应的患者（SD/PD组），其四个生物标志物均同时处于较低水平。样本概况个晚期实体瘤组织样本，涉及25个癌种；在例非小细胞肺癌样本中，研究了CD8、PD-1、PD-L1和TMB之间关系；在33例接受了抗PD-1治疗的非小细胞肺癌样本中，验证了PD-L1、TMB、PD-1、CD8之间的关系，同时还研究了其与抗PD-1治疗疗效的关系。涉及分析方法靶向基因捕获测序肿瘤突变负荷（TMB）分析全外显子组测序(wes)对TMB检测进行验证免疫组化分析：PD-L1、PD-1、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2多重免疫组化分析：PD-1、CD8研究结果详情不同肿瘤中PD-L1的表达概况和肿瘤突变负荷（TMB）概况在不同肿瘤类型中，PD-L1表达水平存在很大差异；其中鼻咽癌的PD-L1阳性率最高（75%）、胸腺癌次之（68%)，而小肠癌是所有癌种中PD-L1阳性率最低的(9%)。所有样本中，有3.6%的样本被定义为PD-L1高表达(PD-L1染色阳性≥50%)。值得注意的是，51%的鼻咽癌和46%的胸腺癌患者属于PD-L1高表达，与之形成鲜明对比的是，子宫内膜癌患者的PD-L1高表达占比是0%。无论肿瘤的错配修复功能（MMR）正常或缺陷，PD-L1表达没有差异(P=0.）。各种肿瘤的中位TMBs中，

最低的是胃肠间质瘤(GIST)：1.27突变/Mb；

最高的是伴有错配修复缺陷（dMMR）的结肠直肠癌：34.36突变/Mb。

在非dMMR的肿瘤中，小细胞肺癌（SCLC）的中位TMB是最高的。

除了胃肠间质瘤、神经内分泌肿瘤、肾细胞癌、胸腺癌之外，另外21种肿瘤中均检测到dMMR，且伴有dMMR的肿瘤也表现出较高的TMBs，这个现象与错配修复通路的功能是相符的(P0.)。PD-L1表达与TMB的关系根据PD-L1水平将所有样本分为三组:PD-L1阴性组、PD-L1低表达组、PD-L1高表达组。分析结果显示“PD-L1高表达组”的TMBs高于另外两组的TMBs(两个P值均0.）。基于本研究所有样本的分析发现，PD-L1和TMB只显示出很小的相关性(SpearmanR=0.)。接着，进一步评估每个癌种中PD-L1表达和TMB相关性发现，在子宫内膜癌和神经内分泌瘤中，PD-L1表达与TMB的相关性最为明显(二者的SpearmanR均0.3，P值分别是0.和0.），而在宫颈癌、错配修复功能正常的胃癌、头颈鳞癌、非小细胞肺癌（非鳞癌鳞癌）、肉瘤中，PD-L1表达和TMB呈现出弱相关(SpearmanR均小于0.3，P均小于0.05）。（详细数据见原文）这些结果可能提示，在肿瘤的发生过程中，PD-L1表达和TMB二者相关的免疫状态和免疫反应机制较复杂，临床应用时需要将其作为独立的因素加以考量。思考：在宫颈癌、胃癌、头颈癌、NSCLC中，PD-L1和TMB的结果极有可能有存在冲突。因此可能还需要联合其他的指标，来辅助临床进行治疗决策。

根据PD-L1表达和TMB水平将所有样本分为4个组：

PD-L1高表达、TMB高PD-L1高表达、TMB中低PD-L1低表达/不表达、TMB高PD-L1低表达/不表达、TMB中低

在“PD-L1高表达、TMB高”的组别中，鼻咽癌的比例最高（14%）。子宫内膜癌、神经内分泌癌、卵巢癌、胆囊癌、乳腺癌、尿路上皮癌、dMMR胃癌、dMMR结直肠癌和pMMR结肠直肠癌，则没有“PD-L1高表达、TMB高”的样本（均为0%）。

既往研究认为，“PD-L1高表达、TMB高”的患者更容易从抗PD-1/PD-L1治疗中获益，“PD-L1高表达、TMB中低”和“PD-L1低表达/不表达、TMB高”的患者其次。而“PD-L1低表达/不表达、TMB中低”的患者，可能对抗PD-1/PD-L1单药治疗耐药，需要考虑联合治疗（抗PD-1/PD-L1治疗联合放疗或者化疗）。

思考：真实世界中“PD-L1低表达/不表达、TMB中低”的患者占比较高，但是由于PD-L1,TMB在预测免疫治疗疗效及预后方面还存在一定的局限性，“PD-L1低表达/不表达、TMB中低”的患者是选择PD-1/PD-L1单药治疗还是免疫联合治疗，可能需要更多维的检测结果来为治疗决策的制订提供参考。

PD-1+Tils浸润与PD-L1表达相关，但与TMB无关

相较于PD-L1低表达/不表达组，PD-L1高表达组的PD-1+Tils浸润率更高(P0.)。这一结果，符合肿瘤微环境中PD-L1的表达主要由Tils浸润所释放的细胞因子诱导的这一原理。“PD-1+Tils浸润”和“PD-L1表达”这二者之间的相关性，在各个肿瘤类别中并不一致。我们观察到在乳腺癌、胆囊癌、头颈鳞癌、黑色素瘤和神经内分泌瘤中这两者存在弱相关性(SpearmanR值都大于0.4)。（详细数据见原文）无论是基于所有样本的分析，还是基于各个肿瘤类型的分析，“PD-1+Tils浸润”与“TMB”之间都没有相关性。这一结果，可能为部分临床试验中TMB预测抗PD-1治疗疗效的失败提供一定的解释。

CD8+T细胞浸润与PD-1+Tils浸润和PD-L1表达相关，但与TMB无关

a：通过多重免疫组化方法对份非小细胞肺癌（NSCLC）样本进行CD8和PD-1蛋白标记：分析CD8+T细胞、PD-1+Tils、CD8+PD-1+T细胞的含量；b：CD8+T细胞与PD-1+Tils呈正相关(SpearmanR=0.,P0.);c-d：CD8+PD-1+T细胞在总PD-1+Tils和总CD8+T细胞中的中位比例并不高，分别为7.8%(IQR3.6-14.7%)和2.4%(IQR0.5-7.6%)；e-f：CD8+T细胞与PD-L1表达呈正相关(SpearmanR=0.,P=0.)，而CD8+T细胞与TMB无相关性(SpearmanR=0.,P=0.)。

既往报道，PD-1可以表达在各种免疫细胞上，既有抗肿瘤的（CD8等）也有促肿瘤的（Treg，MDSC等），微环境中哪种类型的免疫细胞占优势，可能影响抗PD-1治疗的疗效，需要个体化的分析。

也有研究报道，TMB的高低在部分肿瘤中并不能直接反应其新抗原的免疫原性高低，因此部分TMB高的肿瘤可能并不能吸引更多的CD8进入肿瘤。TMB的临床应用，可能需要考虑联合其他指标，提高预测准确性。

PD-L1表达、TMB、PD-1+Tils、CD8+T细胞浸润与NSCLC的免疫治疗（PD-1抑制剂）反应相关在例NSCLC患者中，10例患者接受PD-1抑制剂单药治疗（ORR40.0%），23例患者接受PD-1抑制剂联合化疗（ORR39.1%），单药治疗还是联合化疗二者之间的客观缓解率几乎无差别。在这33例患者中，1例完全缓解(CR)，12例部分缓解(PR)，9例疾病稳定(SD)，11例疾病进展(PD)。而抗PD-1治疗有效的患者（CR/PR组），其样本中检测的PD-L1表达、TMB、PD-1+Tils浸润、CD8+T细胞浸润水平较高，且大多数患者表现出两种或者多种生物标志物水平同时升高的现象。而对治疗没有反应的患者（SD/PD组），其四个生物标志物均同时处于较低水平。

基于以上结果，联合分析TMB，PD-L1，PD-1和CD8，可能更有利于筛选出抗PD-1治疗不应答的患者。因此，本研究认为，基于多种生物标志物预测抗PD-1治疗疗效的准确性可能更好。

讨论

总体而言，本研究结果显示PD-L1表达和TMB在不同的肿瘤类型中存在很大差异，这一点与过往研究结果是一致的；然而，在个别癌种中我们的研究结果与过往研究是存在差异的：

本研究中，黑色素瘤的PD-L1表达和TMB水平均低于过往研究报道的水平，这可能是由于中国地区的黑色素瘤多为黏膜型，而欧美地区的黑色素瘤多为紫外线照射引起的皮肤型，而此前也确有研究表明TMB在皮肤型黑色素瘤中的水平更高。本研究的食管癌PD-L1阳性率也远高于既往报道。

此前研究提出使用“PD-L1表达”和“TMB”这两个生物标志物，可以将肿瘤微环境的免疫状态定义为“高突变炎症型”、“高突变型”、“炎症型”和“非高突变非炎症型”，根据我们的研究结果，中国人群的鼻咽癌、非小细胞肺癌、头颈鳞癌也可以用同样的方法进行分类，但是子宫内膜癌，乳腺癌，尿路上皮癌，结直肠癌却不适用于这种免疫微环境分型方法，因此免疫检查点抑制剂单药治疗这些癌种的疗效可能需要更多临床试验的验证。在肿瘤的发生过程中，PD-L1表达和TMB二者相关的免疫状态和免疫反应机制较复杂，临床应用时需要将其作为独立的因素加以考量。

此前一项小样本量的肺癌研究显示Tils与PD-L1表达之间存在弱相关性，而与TMB无关。我们的研究在更大样本量（例）中评估了这三个生物标记物与肺癌的相关性，得到了与之前的研究相一致的结果。这些结果，符合肿瘤微环境中PD-L1的表达主要由Tils浸润所释放的细胞因子诱导的这一原理。“Tils”与“TMB”之间不相关的结果，可能为部分临床试验中TMB预测抗PD-1治疗疗效的失败提供一定的解释。

本研究中小队列的抗PD-1治疗结果提示，联合分析TMB，PD-L1，PD-1和CD8，可能更有利于筛选出抗PD-1治疗不应答的患者。因此，基于多种生物标志物（如TMB，PD-L1，PD-1和CD8等）预测抗PD-1治疗疗效的准确性可能更好。

总之，除了TMB和PD-L1这两个重要的标志物之外，建立一个包含多种生物标志物（例如PD-1、CD8、dMMR/MSI-H、单基因驱动突变EGFR/KRAS/ALK、肠道微生物群、外周免疫细胞、循环肿瘤DNA、外周细胞因子等等）的综合评估框架，对于研究肿瘤的免疫状态，辅助指导患者的免疫检查点抑制剂治疗具有重要意义，臻和“百适博?+朗蒂思TM”联合送检可实现多维度综合评估。

结语

本研究的优势在于，我们使用的分析方法是在CAP认证的实验室中经过充分验证的，并且被分析的样本均是来自于临床的具有代表性的中国实体瘤患者，也是目前为止，样本量最大的报告中国实体瘤患者PD-L1表达、TMB水平等标志物的研究。本研究分析了中国人群25种晚期实体肿瘤的PD-L1表达、TMB水平、Tils浸润情况，并探索了它们之间的关系；这些数据可能对于指导中国实体瘤患者的免疫检查点抑制剂治疗具有临床价值。