人体液中的外泌体水平可以作为肿瘤标志物吗

摘要

虽然人们进行了相当多努力的研究，但是我们仍未找到可靠的肿瘤标志物。近年来，细胞外纳米囊泡或外泌体已经被确定为一种具有极大潜力的新型生物医学诊断工具。大多数细胞都能释放他们，并包含了原始细胞分子信息的细节，包括肿瘤标志物。外泌体可以很容易总体液中分离出来，更为重要的是，他们能够提供具有不同特异性的生物标志物。最近的临床证据表示释放到体液中的外泌体水平可以预测或诊断肿瘤，并能将癌症患者和健康受试者区分开来。这篇综述的目的是通过回顾这些具有挑战性的发现来为肿瘤早期诊断和随访的提供新的创造性的方法。

1.介绍

近年来的研究已经证实体液中包含了大量的大小在30-nm之间的细胞外囊泡（EV），他们被具有不同特点的微领域的磷脂膜所包围，例如脂质筏及细胞膜微囊。目前已经发现的细胞外囊泡主要有两种：纳米级的外泌体（30-nm），即胞内体的衍生物，以及通过质膜向外出芽产生的微泡（-nm）。

外泌体可以被大多数类型的细胞所释放，并能够介导靶细胞生理及病理生理状态下的信息传递，这当中包括了不同类型的癌细胞。图1显示的是具有代表性的植入环氧树脂的人肺粘液表皮样细胞和同一种细胞中的外泌体的电子显微镜图像。存在于多泡体内的不同类型的细胞内囊泡的大小变化已经是明确了，而相同的变化也出现在通过重复超速离心法减少囊泡直径的方法纯化细胞外囊泡所得到的外泌体上。与此同时，其他的超微结构也能够帮助区分外泌体及其他细胞外囊泡，如典型的双层膜结构（图1B和C）。

由于细胞外囊泡包含了细胞特异性标志，因此有人认为它们可能可以作为不同类型疾病的标志物。他们由不同类型的分子构成，包括蛋白质、脂质、代谢物和核酸，所有的这些都代表了原始细胞。根据他们的分子特征，他们可以到达位于局部或远处、器官内或器官之间的靶细胞。这些特征决定了细胞外囊泡可以作为医学上潜在的最为可靠的标志物。很多来自癌症患者队列研究中的临床数据也支持将细胞外囊泡作为疾病生物标志物来使用。当然了，这对于肿瘤病人的临床决策非常重要。但是遗憾的是，对于人类疾病的整体而言鉴别疾病的特殊生物标志物不能够满足临床需求。然而，科学界正在为找到疾病相关的新的细胞外囊泡做着巨大的努力，而细胞外囊泡还可能成为新治疗方法的特异性靶点。

2.现有肿瘤标志物的缺点及血浆外泌体的作用

目前癌症患者的诊断和随访缺乏特异性的标志物。事实上，临床肿瘤学家经常使用合适的全部标志物，并且通过其他非特异性标志物去全面了解病人的健康状态。现有的血浆标志物水平会随着疾病状态、治疗副反应及同时存在的临床并发症而改变。此外，低特异性的肿瘤生物标志物水平往往会在因为其他疾病而增加，这可能会导致误诊，因此它们并不适合用来进行疾病的筛查。一个非常显著的例子是有一个最常使用的叫做前列腺特异性抗原（PSA）的肿瘤生物标志物，它作为前列腺癌（PCA）标志物而在全世界广泛使用。事实上，从几十年前开始血清PSA定量检测就已经被于PCA的筛查，并很快就替代直肠指检以便于早期发现前列腺癌。然而由于包括前列腺良性增生（BPH）在内的假阳性的存在，这种诊断方法存在争议。由于PSA检测不能够区分BPH和肿瘤，过度诊断和过度治疗是一个非常常见的问题，并会因为总所周知的治疗副作用而增加患者的痛苦。PSA值超过4.0ng/ml就会被认为是异常，但是这个值会因为年龄、种族和个人生理情况而改变，这种情况在过去的几十年都没有取得进展。有趣的是，一些临床预实验已经表明血浆及尿源性的EVs中能够检测到PSA。这表明旨在研究血浆和尿液纳米级囊泡与PSA的量化及特征之间的关系的研究可能有助于区分癌症和良性肿瘤，并推广到男性人群的筛查。这对于眼下实际上并不是特异性的临床肿瘤标志物来说也是如此的。目前，可以用于癌症筛查及诊断的标志物通常表现出非常低的特异性，一定程度的敏感性，在疾病早期不能够发现肿瘤（假阴性）或者是误诊那些本来没有疾病的人（假阳性）。肿瘤衍生的细胞外囊泡被认为携带了肿瘤特异性的分子标记，这种特征决定了他们是潜在的肿瘤诊断标志物。EVs能够通过连续超速离心的方法从几乎所有的体液中纯化，包括血液和尿液。在最近的报告中，关于EVs作为疾病标志物的临床证据在迅速增加。事实上，由于他们的结构复杂，相对于现有的可用的临床标志物而言，外泌体作为潜在的标志物可能具有更好的敏感性和特异性。目前多数临床研究都在描述外泌体制剂作为新的检测标志物，但是很少有研究是聚焦于这些发现的临床相关性。因此对于这个问题，现在还很难得出一个非常明确的观点，临床数据是如此的分散以致于实际上不可能给出建议，而只能对于单个报个进行分散性的总结。结果是目前还没有临床研究能够提供一个可信的证据表明血浆EVs携带了疾病标志物，或者是在有肿瘤的情况下，标志物能够清楚的区分不同肿瘤组织。这就是这篇综述的目的，我们只是给读者建议了一些最近关于这个主题的文章。

无论如何，虽然有很多研究都表明外泌体可能包含了可以用于肿瘤早期诊断和随访的提一下标志物，但是对于癌症学家来说这些标志物也仅仅只是一种梦想。我们的假设是，“与其看手指，不如看天空“：肿瘤患者的血浆外泌体水平比对照人群的更高。现有的关于肿瘤患者各种体液EVs水平的临床数据并不支持它作为特异性生物标志物。然而，一些临床前研究确实表明肿瘤释放的外泌体可以成为生物标志物的优选载体。在这种情况下，一个转化研究提供了基于免疫捕获的ELSA试验量化人类体液EVs的可行性的证据。这个试验已经表明通过使用替代肿瘤标志物，如细胞质膜微囊蛋白，或者是简化外泌体管家标志物如CD36，循环外泌体水平可以代表肿瘤质量；与健康志愿者对比，使用这两个参数得到的肿瘤患者的EVs标志物更高。在这篇文章中还显示了血浆外泌体水平与肿瘤大小相关的数据。一些临床前实验数据已经证实肿瘤的微环境状态，比如细胞外的酸性可以增加外泌体的释放，而通过使用各种抗酸的方法，比如缓冲液和质子泵抑制剂可以抑制外泌体的释放。特别要指出的是，肿瘤的酸性环境也可以增加肿瘤血浆外泌体水平。这表明，与健康或者良性肿瘤不同的是，恶性肿瘤患者相同组织的微环境可能更加有利于外泌体表面的肿瘤标志物存在，例如一些酶如PSA需要酸性微环境来完全激活。这种情况也可能存在于生存素上，它存在于前列腺癌患者血浆外泌体，并已经被建议用于前列腺癌的早期检测标志物。

3.血浆外泌体水平是否是肿瘤进展和复发的标志物？

第一个支持人类体液EVs水平可以代表肿瘤进展的潜在标志物这个观点的证据是一个基于免疫捕获的临床试验。这个研究表明，于正常志愿者相比，相当多数量的晚期恶性黑色素瘤病人血清外泌体水平明显升高。更为特别的是，III期和IV期的恶性黑色素瘤患者显示出更高的血浆细胞质膜微囊蛋白-1和CD63阳性的EVs水平。EVs相关细胞质膜囊蛋白-1显示出现69%的敏感性和96.3%的特异性，而用于恶性黑色素瘤随访的常规癌症标志物，如乳酸脱氢酶（LDH）只改变了12.5%的病人。这些结果已经被最近的一个研究证实了，该研究发相对健康对照人群而言，恶性黑色素瘤病人的MIA及SB阳性外泌体显著升高。最近另一篇论文也提出了这个假说，这篇论文通过流式细胞分析发现各类血液肿瘤患者的血清外泌体水平比明显高于健康受试者。有趣的是，他们还发现循环血纳米囊泡上的标志物反映了细胞来源，如B细胞肿瘤的CD19，多发性骨髓瘤的CD38，髓系肿瘤的CD13和霍奇金淋巴瘤的CD30。根据这些研究结果，最近一个的通过时间分辨荧光免疫测定时捕获的CD9和CD36阳性外泌体数量的研究表明PCA病人体液中的纳米囊泡水平增加了。另一个在结直肠癌病人中进行的研究证实了在其他组织类型的肿瘤中的结果。通过对91个结直肠癌病人的血浆纳米囊泡水平进行定量，结果显示他们比健康对照人群显著升高。此外，外泌体水平跟高水平的血清癌胚抗原（CEA）相关。进一步的分析显示外泌体水平跟较低的肿瘤分化程度及更短的总体生存显著相关。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）技术的测定，前列腺癌患者的血浆EV浓度比健康对照人群高的多。最近，一个里程碑式的研究表明，胰腺癌病人血清可以检测到具有高度特异性及敏感性的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1（GPC1）阳性外泌体，并可以用来区分健康受试者、良性胰腺肿瘤和早期及晚期胰腺癌病人。然而，这个研究也同时发现乳腺癌病人也能检测到高水平的纳米级EVs上的GPC1，这表明循环血EVs的升高可能是恶性肿瘤存在的一个信号，并且可以在临床上用于癌症病人的随访。这也表明循环血EVs是一种良好的肿瘤筛查工具，并可用于临床状态的评估。

有趣的是有数据表明循环血EVs也可以用于评估癌症病人治疗的有效性。例如，通过监测伊马替尼治疗胃间质瘤病人的效果发现治疗前的EVs浓度高于对照人群。此外，一个用质子泵抑制治疗具有人类黑色素瘤的异种移植物的临床前实验发现血浆EVs水平跟肿瘤大小的缩小相关。

一个最近刚刚发表的有趣的研究发现与未照射的肿瘤细胞相比，经过照射的肿瘤释放的EVs增加了。作者还发现，与未照射相比，无论是否接受过照射的EVs摄取增加的细胞在接受照射后生存增加了。这个研究证实在头颈部肿瘤细胞中，辐射影响了细胞外泌体的数量和效应，而外泌体通过促进细胞分化及放射抗拒来存进生存。新的“液体活检“概念已经包括了循环血EVs。这对临床结果来说是非常重要的，并且支持了这样的假说：血浆EVs水平可以成为有价值的肿瘤标志物，另外还有临床前数据表明外泌体水平跟肿瘤大小相关。还有人建议循环血EVs的数量成为一个新的类别，并第一次被称为”液体肿瘤“。这个观点还需要大量的临床试验进一步证实，循环血外泌体水平与肿瘤大小的相关还需要常规诊断方法验证，包括CT扫描、MRI和PET。然而，”液体肿瘤“（LTM）的概念还应该包括EVs可以代表肿瘤的扩散转移，不仅仅是局限于在原发部位制备到达靶器官的循环血肿瘤细胞，还应该包括向肿瘤样干细胞转化。重要的是，目前就需要量化循环血EVs的方法达成一致。事实上，这篇综述里的所有研究中EVs水平的定量方法是完全不同的：基于ELISA的免疫捕获，基于NanoSgiht技术，流式细胞技术和EVs纯化中的简单蛋白纯化计数。值得注意的是，所有的研究得到了相同的证据：肿瘤病人比健康个体有更高的循环血EVs水平。然而，如果我们想将这种方法用于临床实践中，我们需要找到一个最可靠的，也许便宜的，可以用于全球临床癌症实验室的方法。

另一个重要的问题是如果使用高度特异性标志物，也许就可以改善癌症患者EVs水平评估的方法。为此，需要开展寻找新的EVs相关的分子，包括蛋白质、脂质和核酸。然而，这种方法应该从评估EVs上已知的特异性表达的肿瘤标志物开始。这可以很好的包括从部分病人中观察到的分散性结果，如结肠癌患者中CEA，但是还应该包括其他很多报告中所涵盖的所有癌症患者临床管理中的标准肿瘤标志物。

目前一些潜在的生物标志物已经在研究中，包括在早期诊断前列腺癌中已经被确定为有前途的替代生物标志物—生活素。还有在黑色素瘤患者中血浆中检测到表TYRP-2，VLA-4，HSP70和HSP90的EV水平升高。为了了解伴侣蛋白在癌症发病和进展中的作用，最近已经已经开始研究一组伴侣蛋白，包括属于热休克蛋白（HSPs）的HSP70和HSP90。值得注意的是，在手术切除肿瘤之后，结肠癌患者的EV相关HSP60显著降低了。这表明癌症病人手术之后的随访，包括诊断和复发是循环血EVs量化最有意义的应用之一。通过比较惰性和侵袭性前列腺癌与非癌症状态下EVs的Nglycan谱所获得结果是非常显著的。表1总结了一系列对体液中生物标记物的发现至关重要的临床数据。除了血液之外，尿液是在临床管理癌症病人时很容易利用的体液，特别是泌尿生殖道恶性肿瘤的病人。有趣的是，如Pocsfalvi所证明的，尿EVs的蛋白质组学分析能够可靠地反映了某些肾脏病理。作者表明多囊蛋白1和多囊蛋白2的表达，与其他Ca2+绑定蛋白（膜联蛋白A1，膜联蛋白A2，蛋白S-A9，蛋白S-A8和视黄酸诱导蛋白3）发生显著的改变。

总体来说，这些可用的数据表明人体液中EVs的定量和鉴定作为癌症病人的临床管理是一个非常有用的无创性诊断工具。我们建议将定量循环血EVs作为一个非常重要的研究终点来追求。

4.总结

目前用于肿瘤筛查及临床随访的肿瘤生物标志物是非常低效及不可高的工具。在过去的几十年中，有大量的数据支持生理及病理状态下细胞外释放的囊泡是非常重要的。特别的是，一些研究表明，EVs本质上是穿梭出去的蛋白质、脂质和核酸（包括mRNA和miRNA）。由于在早期诊断（二级预防）之后缺少除了手术之外的有效治疗方法，因此迫切的需要一种有效的、无创的并且负担的起的新的癌症诊断工具。这篇综述提出了人类体液细胞外囊泡（EVs）水平是可以用于筛查和诊断癌症及癌症复发的非常有效的工具。这种观点的真正挑战在于如何定量的检测全部循环血中用于区别癌症及健康个体的EVs数量。我们在这里强调目前EVs相关标记并没癌症类型的特异性，而只是有助于量化循环血EVs。在我们看来，测量病人体液中外泌体水平可以成为实现癌症诊断和/或随访的简单并便宜的方法。

我们已经知道外泌体可以融合靶细胞质膜将其内容物传递给受体细胞，并可能改变他们的生物学特征。因此，作为一个非常有价值和有效的“纳米载体”，EVs不仅可以成为未来的医药生物标志物，而且也可以成为化学或生物药物。最近发现EVs可以从基因转移到种系，因此可能对我们的基因组变化产生作用，这表明他们也可以基因治疗的理想载体。事实上，通过生物工程方法改变其内容物可能是“治疗诊断学”领域的临床科学家的另一个重要终点，旨在使用这些同时是追踪剂和治疗因子的分子。

总之，外泌体学领域正在迅速扩张，并且未来看起来是很有希望的。该领域专家之间的科学讨论对不久的将来实现目标是至关重要的，这些讨论集中在为目标病人优化经济资源。我们建议在癌症病人体液中EVs量化定义为早期癌症及复发癌症病人的“液体肿瘤”，同时我们希望这篇文章能够引发富有成效的讨论。

通过这张电镜图我们希望总结一下外泌体形成和分泌的机制：1.胞浆膜上的网格蛋白微结构向内出芽；2.腔内囊泡（ILV）形成，其向内出芽并夹紧到多囊泡体的腔内。3.外泌体的细胞外分泌。

上图A显示了含有多囊泡体（MVBs）的细胞包埋体填充了接近细胞浆膜的不同大小的囊泡，包括纳米囊泡。图B显示的是被环氧树脂包埋和切开的分泌了典型超微结构特征的外泌体：30-nm大小及脂质双层。图片显示了单个囊泡和囊泡簇。图C显示了直径在80-nm之间的不同大小囊泡的细节。

进一步的细节描述：通过超速离心获得细胞外囊泡。简而言之，收集50ml无细胞媒介，并在4℃下以13,转离心20分钟，以减少和除去小的细胞碎片和线粒体污染物。收集上清液，通过在4℃下以,转超速离心2小时获得外泌体。收集沉淀并用PBS冲洗1此，再悬浮于含有蛋白酶抑制剂的ulPBS中，然后储存在-80℃直至使用。外泌体悬浮液用Karnovsky固定剂固定，然后包埋，就可以在电子显微镜上使用了。

文章来源：F.Cappelloetal.EuropeanJournalofPharmaceuticalSciences96()93–98。

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