肿瘤个体化治疗检测技术指南试行

肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）

6.分析后质量保证6.1检测结果的记录

1）检测结果的报告应准确、清晰、明确、客观和及时，杜绝虚假报告。

2）仪器原始数据要仔细分析，根据质控品判断PCR扩增的有效性，只有当质控品的扩增结果符合项目SOP有关条件时，才可发出报告，否则应重新测定。

3）患者档案及测定结果一并录入“检验管理系统”。报告内容至少应包括：实验室名称、患者姓名、性别、年龄、测定项目、检测方法、检测结果、参考范围、用药建议及样本号、样本类型、检测日期、实验操作者、审核者、报告日期、实验室联系方式等。否则视为无效或虚假报告单。

6.2失控结果的记录与分析

如发现质控数据违背了控制规则，操作员应填写失控记录或失控报告单，上交实验室主管，由专业主管做出是否发出与失控质控品同批患者样本检测报告的决定。失控信号一旦出现就意味着与失控质控品同批患者样本报告可能作废。此时，首先要尽量查明引起失控的原因，如为假失控，可由实验室指定的资深人员决定、签字后发出报告。如为真失控，最好是纠正原因后，全部样本重新检测，质控品测定合格后再签字发出。

6.3报告及解释

1）报告的编写需要有严谨有效的流程，以确保检验信息的完整、有效、及时、正确，并保护患者的隐私。检测结果以检测报告单的形式发放，需提供纸质版检测报告，有条件的检测实验室可以电子版的形式发放报告，并建立网络查询系统，送检医生通过登陆网站进行检测结果的查询。

2）检验报告单的应具有患者基本信息、样本情况（采集、送检及检测时间、样本性质及状态等）、检测项目、检测方法、结果、结果的意义、用药建议、检测可能的局限性、检测单位联系方式、检测人员与报告审核人员签字，审核者应当是主管技师以上的工作人员、本专业实验室负责人、中级及以上的病理医师，审核者对检验报告的质量负责。

3）结果解释的责任属于临床实验室，应根据所检测的人群解释结果。临床解释的责任属于临床医生，其应根据检测结果和临床信息向患者解释检测结果。综合临床分子诊断的实验数据和临床信息，为医师和患者描述此结果对疾病诊断的含义，为个体化用药提出建议。

6.4记录保留

患者和样本信息：接收样本后，在“样本接收记录本”中记录患者和样本信息，对不符合检测要求的样本在“样本拒收登记本”上记录，并及时通知患者。《样本检测申请单》最后保存于扩增区，至少1年以上；其它实验记录保存于各自实验操作区内，至少保存1年以上。《检测过程实验记录》保存于扩增区的专用文件柜内，以备查找。扩增过程中由荧光扩增仪产生的数据文件必须保存在非系统分区的专门文件夹中，定期做备份。

6.5检测后基因咨询

实验室建立科学的、系统的检验结果解释方案，提供结果的解释意见。报告单上提供咨询服务的方式和途径，如客户服务专线，配置专业的咨询服务人员；方便临床医生和患者随时反馈意见和提出咨询。

6.6样本（及核酸）保留与处理

肿瘤个体化治疗基因检测报告发出后的样本应尽可能较长期保存。实验室应制定样本储存制度对样本进行保存，建立样本储存的规章制度，做好样本的标识并按规定存放，保存好样本的原始标码，建立配套的样本存放信息管理系统。

样本的处理和相关材料的处理要符合《医疗废物管理条例》、《医疗卫生机构医疗废物管理办法》及国家、地区的相关要求。

6.7检测与临床数据收集与分析

检测结果收集、整理分析和数据的管理也是保障临床基因检测质量的关键环节。临床的检测结果应定期统计分析，如基因突变的阳性率，如果发现阳性率高于资料报道值，应引起重视，考虑是否存在假阳性情况，如果阳性率偏低，应结合检测方法的局限性考虑假阴性的可能，并进行针对性的改进。

7.肿瘤个体化治疗检测的质量保证7.1标准操作程序

原则上按照《个体化医学检测质量保证指南》的要求进行。肿瘤个体化治疗的检测SOP，应包括试剂准备、样本采集、样本接收与预处理、核酸提取、检测方法、结果分析和报告、仪器操作、实验室安全措施等临床检验的所有环节。SOP的编写应注意通俗易懂、注重细节、清晰明了、图文并茂。实验室工作人员应严格遵循SOP中的步骤要求进行操作，应每年定期根据实验室的运行状况进行SOP审核修订，对于文件的修订、废止、改版或更新，要按照规定的要求，合理且规范进行，并防止无效或作废版本文件使用。

7.2质控品

检测质控品的建立是为了提高实验室检测结果的可靠性和可重复性，一般情况下，针对发现罕见的基因突变、实验运行异常、新批次的试剂与上一批次试剂的比对、储存条件或反应温度发生改变后的样本和试剂、验证整体测试可靠性的样本等，都应合理设置质控品。

7.2.1质控品类型

阳性对照：以含有目的片段的DNA(或质粒）作为模板进行扩增，证明PCR试剂是否有效、扩增过程是否正确。但阳性样品扩增效率高，应严格控制其浓度和存放位置，避免其成为潜在的污染源。例如，检测基因突变时，应根据选用的检测方法，选择该方法最低检测限的阳性样本。

阴性对照：以不含有目的片段的阴性样品作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。

空白对照：以纯水作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。

PCR抑制物对照：在与阳性对照相同的反应体系中，加入相同数量的待测样品DNA，如果未扩增出目的片段，证明此待测样品DNA中存在PCR抑制物。

空白提取对照：空白提取对照扩增结果为阳性，说明DNA提取试剂或过程中可能受到污染。

阳性提取对照：阳性提取对照扩增结果为阴性，说明提取过程可能有误。如果DNA阳性对照扩增结果为阴性，或者DNA阴性对照和空白对照扩增结果为阳性，则说明PCR试剂或扩增过程存在问题。

基因检测单核苷酸多态性（SNP）时，需要设置多个阳性对照用于检测野生型纯合子基因型、杂合子基因型，突变纯合子基因型。质控应尽可能模拟临床样本，如基质或采样方法与待测样本相同。

7.3室内质量控制

原则上按照《个体化医学检测质量保证指南》的要求进行。建议按照以下原则设定室内质量控制：

（1）如果只检测1个基因突变，定性测定有一份接近CUT-OFF(2~4倍)的弱阳性和一份阴性质控样本即可。质控品的设置数量随检测样本数的增加而按比例适当增加，例如临床样本数量达到50~60份，则可将阳性和阴性质控样本的数量翻倍。质控品应随机放置在临床样本中间随同临床样本一起同时处理。

（2）当同时检测多个突变基因时，可以根据实验室自身的条件，可只设立能最灵敏地反映检测问题的2个或3个突变基因的阴阳性质控，下次检测改用跟上次不同的基因突变的阴阳性对照，依次类推，循环往复。另外，质控样本在扩增仪中的位置不应持续性的固定在同一个孔，而应在每次扩增检测时，进行相应的顺延，尽可能在一定时间内可以监测到每一孔的扩增有效性。

如果每次质控品的检测结果均成立，说明结果可信，报告可以发出；反之，就要对这种情况出现的原因进行分析。在找不到合理的解释的情况下，须将不符合的基因突变和其相应的对照重新检测。

此外，临床样本中每次检测阳性和阴性结果的出现频率，以及同一基因型或基因突变出现频率或连续出现频率等，均可作为提示实验室“污染”的质控指标。

7.4室间质量评价

临床检测实验室应参加室间质评（EQA），详细、如实地记录参与EQA的全过程，根据反馈结果了解本实验室的能力、自查存在的问题，及时寻求改进方法，解决问题，完善实验室质量控制体系。

7.5PCR污染控制

由于肿瘤基因突变检测时必须设置阳性质控品，阳性样本加样时、PCR扩增的产物可能成为PCR实验室的主要污染来源，而PCR的敏感性和效率特别高，所以少量的扩增产物污染样本或反应管即可出现假阳性。尤其是PCR扩增产物和质粒分子很容易造成实验室的污染，导致假阳性现象发生。通过规范实验室设计、规范试剂耗材管理、规范实验室操作和技术处理来控制污染。

常见的PCR污染有样品间交叉污染、PCR试剂的污染、PCR扩增产物污染、气溶胶污染和实验室中克隆质粒的污染。

污染控制：规范实验室设计、规范试剂耗材管理、规范实验室操作和技术处理，如PCR扩增实验中使用dUTP，而不用dTTP。

附录A：常见的检测项目A.1基因突变检测项目A.1.1EGFR基因突变检测

EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物，是表皮生长因子受体（HER）家族成员之一。HER家族由EGFR/HER1/erbB1、HER2/neu/erbB2、HER3/erbB3及HER4/erbB4四个分子构成，在细胞的生长、增殖和分化等生理过程中发挥重要的调节作用。

EGFR的突变主要发生在胞内酪氨酸激酶（TK）区域的前四个外显子上（18~21），目前发现的TK区域突变有30多种。缺失突变主要发生在外显子19上，最常见的是delE-A，替代突变最常见的是发生在外显子21上的LR，复制或插入突变发生在外显子20上。发生在外显子20上的替代突变TM为耐药突变，研究还发现LQ、DY、TA等耐药突变。

EGFR-KTI的有效性也因突变类型而不同，外显子19缺失突变的有效率为81%，LR的有效率为71%，GX的有效率为56%。吉非替尼初期有效的全部患者，在后期均产生耐药。其中50%患者是在19外显子缺失或LR点突变等的敏感突变的基础上，又发生了第位密码子苏氨酸向蛋氨酸的突变（TM）。研究发现有约1～3%的患者在TKI治疗前即存在TM，即原发耐药，这种情况下TKI治疗难以有效。

经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋的非小细胞肺癌肿瘤组织。

推荐ARMS或Sanger测序法进行EGFR突变检测，可考虑采用新一代测序技术同时进行肺癌驱动基因的检测。

（1）预测药物疗效：EGFR是HER/ErbB家族信号通路的首要分子，吉非替尼、厄洛替尼等小分子TKI进入细胞内，直接作用于EGFR胞内的激酶区，干扰ATP合成，抑制酪氨酸激酶的活性，阻断激酶的自身磷酸化及底物的磷酸化，彻底阻断异常的酪氨酸激酶信号传导，从而阻止配体介导的受体及下游信号通路的激活，阻滞细胞在G1期，促进凋亡，抑制新生血管形成、侵袭和转移，达到治疗的作用。小分子TKI的疗效与EGFR基因突变密切相关，是TKI疗效预测因子。

（2）预后评价：根据是否使用EGFR-TKI对肺癌切除后患者进行预后分析，EGFR敏感性突变并服用TKI的患者至少在单因素分析中有预后良好的趋势。但是，EGFR基因突变与女性、非吸烟者等这些传统的预后良好因子有交叉，只分析基因突变进行预后评价几乎是不可能的。

（1）吉非替尼、厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制剂的疗效与EGFR基因发突变密切相关，特别是当第19外显子缺失、第21外显子突变（LR）和第18外显子突变（GX）的患者，使用吉非替尼、厄洛替尼等小分子TKI可获益。

（2）约1~3%未经TKI治疗的NSCLC患者第20外显子存在TM突变，但经TKI治疗后超过50%后耐药的患者出现TM突变阳性，导致TKI治疗失败。也有报道认为LS、D76IY、TA突变阳性时，患者也会对吉非替尼、厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制剂耐药。

临床实践表明，并不是所有携有EGFR突变的NSCLC患者都对酪氨酸激酶抑制剂有效，EGFR-TKI的有效性因突变类型而不同，如对外显子19缺失突变的肿瘤患者有效率为81%，LR的有效率为71%，GX的有效率为56%，而有些患者发生第20外显子插入突变却对TKI无效。另外，约10%的EGFR野生型NSCLC患者对酪氨酸激酶抑制剂有效，但其机制尚不明确。

A.1.2KRAS基因突变检测

哺乳动物基因组中普遍存在三种RAS癌基因家族成员：H-RAS、K-RAS、N-RAS，这三种基因编码的蛋白质大约有90%的氨基酸同源序列，分子量均为21kDa，故称为RASp21蛋白，其在功能上与G蛋白相似，可与二磷酸尿苷（GDP）结合为非活性状态，与三磷酸尿苷（GTP）结合为活性状态，RASp21蛋白自身具有弱GTPase活性，位于细胞膜内侧参与跨膜信号传递作用。KRAS基因是RAS基因家族中三种癌基因的一种，位于12号染色体上，含有4个编码外显子和1个5’端非编码外显子，共同编码含个氨基酸的RAS蛋白。KRAS是表皮生长因子受体功能信号的下游分子，属膜结合型GTP／GDP结合蛋白，通过GTP和GDP的相互转化作用有节制的调节KRAS基因对信号系统的开启和关闭，传递细胞生长分化信号。

KRAS基因突变发生在肿瘤恶变的早中期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因状态基本保持一致。目前研究发现，KRAS基因在膀胱、乳腺、直肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胃，还有造血系统等均在一定频率的突变，其中以结直肠癌、胰腺癌和肺癌的发生率比较高，在胰腺癌组织高达90％以上，在肺癌中则以肺腺癌为主，突变率为20～30％，结直肠癌患者突变率为27～43％。当KRAS基因催化活性区突变时，该基因永久活化，不能产生正常的RAS蛋白，导致RAS蛋白不依赖EGFR受体激活而持续活化，造成RAS信号通路的异常活化，影响细胞的生长、增殖和分化，促进细胞的恶性转化，导致细胞增殖失控而癌变。

KRAS基因最常见的突变方式为点突变，90％的KRAS基因突变位于2号外显子的第12和13密码子位点，另有1～4％为第61和密码子突变。其中结直肠癌中第12密码子（约82％）是最常见的突变位点。一般中国人群样本检测数据G12A高于G12S/C，西方人群相反。

经10%中性福尔马林固定石蜡包埋的结肠癌/肺癌肿瘤组织，或者与原发灶具有同样病理形态的转移组织。

可以采用Sanger测序法，也可采用灵敏度高的ARMS-PCR等。

西妥昔单抗和帕尼单抗均通过直接抑制EGFR从而发挥抗肿瘤的作用，在结直肠癌和头颈部癌的靶向治疗中都有肯定的效果。西妥昔单抗治疗的有效性受其下游基因KRAS状态的影响，突变型的KRAS无需接受上游EGFR信号即能够自动活化该通路并启动下游信号的转导。因此只有KRAS基因野生型的患者才能从抗EGFR的治疗中获益，而突变型的患者则不能。

KRAS野生型患者使用西妥昔单克隆抗体和帕尼单克隆抗体治疗效果确切，可显著提高患者的生存率和改善生活状态，建议使用；而KRAS的2号外显子的12号密码子和（或）13号密码子或其他密码子任意突变型患者使用西妥昔单抗和帕尼单克隆抗体抗治疗无效，建议不使用该类药物。而在进行结肠癌靶向药物治疗时，应询问所有结肠癌患者的家族史，如果怀疑患者有遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)、家族性腺瘤性息肉病(FAP)和轻表型家族性腺瘤性息肉病(AFAP)，除非是进行临床试验，否则不应使用贝伐珠单克隆抗体、西妥昔单克隆抗体、帕尼单克隆抗体或伊立替康。

临床实践表明，只有50%的野生型KRAS患者对抗EGFR治疗有效，提示EGFR下游信号通路其他分子的激活和变异可能影响了其治疗反应。因此，KRAS基因突变的检测仅用于预测结直肠癌对抗EGFR靶向药物的治疗效果。

A.1.3BRAF基因突变检测

BRAF基因是年由Ikawa等首先在人类尤因肉瘤中发现并克隆确认的一种能转染NIH3T3细胞且有活性的DNA序列。BRAF基因与ARAF、CRAF基因同属RAF家族，命名为鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1，位于人染色体7q34，长约kb，编码个氨基酸的蛋白，相对分子质量为，有CR1、CR2和CR3三个保守区。BRAF是Ras-Raf-MEK-ERK信号转导通路重要的转导因子，具有功能的编码区由对碱基组成，主要通过有丝蛋白激酶通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶来发挥作用，该酶将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接，启动多种因子参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡。研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌，均存在不同比例的BRAF突变。

BRAF突变主要有两种类型：1.11%位于exon11上的甘氨酸环，如G、G、G的点突变；2.89％的突变发生在exon15上的激活区，其中约92％位于第核苷酸上，T突变为A(TA以前认为是TA)，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(VE以前被认为是VE)。此外，仅不到1％的癌组织同时存在BRAF突变与RAS突变，且在这1％中，BRAF突变几乎均为非VE突变。以上两种类型的突变均能使BRAF激酶活性及NIH3T3细胞转化能力提高，但以后者更为重要。VE突变能模拟T和S两个位点的磷酸化作用，使BRAF蛋白激活。

年FDA批准维罗非尼用于治疗晚期（转移性）或不可切除的黑色素瘤，尤其是携有BRAFVE基因变异肿瘤者。该药的安全性和疗效评估基于一项国际单中心研究。该研究纳入例BRAFVE变异的初治晚期黑色素瘤患者，入选者被随机分入维罗非尼组或达卡巴嗪组。结果显示，在维罗非尼组患者未达到中位生存期终点时（77%的患者生存），达卡巴嗪组患者中位生存期为8个月（64%的患者生存）。该药最常见副作用为关节痛、皮疹、脱发、疲乏、恶心和皮肤光敏感。

中国黑色素瘤患者中BREFVE变异率接近26%，虽然不如白种人（约50%）的变异率高，但仍有可能通过这个药物治疗我国1/4黑色素瘤患者，因此该药物对于黑色素瘤患者的治疗有着十分重要的意义。

经10%中性福尔马林固定石蜡包埋的结肠癌肿瘤组织和黑色素瘤组织。

BRAF基因突变的检测方法进可以采用Sanger测序法，也可以使用ARMS-PCR等方法进行检测。

（1）BRAF是位于KRAS下游级联信号通路上的一个重要蛋白，当BRAF基因发生突变后，其编码生成的蛋白产物无需接受上游信号蛋白的活化便始终处于激活状态，启动下游细胞信号转导途径，引起细胞增殖，从而使EGFR抑制剂西妥昔单克隆抗体和帕尼单克隆抗体等疗效减弱或无效。

（2）BRAF基因可作为患者预后评价的独立性指标，BRAFVE突变患者呈现预后更差的趋势。

(3)BREFVE基因突变的黑色素瘤患者对维罗非尼治疗有效。

(1)对于KRAS基因野生型但同时具有BRAF基因VE突变的患者，抗EGFR单克隆抗体靶向药物治疗可能无效。（2）回顾性亚组分析显示，无论BRAF基因VE是否存在突变，一线治疗采用抗EGFR单克隆抗体联合有效的化疗药物都有可能使患者获益。目前有限的研究数据提示，一线治疗后病情进展的患者，如果存在BRAFVE突变，使用抗EGFR单克隆抗体的疗效欠佳。

（3）50%以上表达BRAFV突变的晚期黑色素瘤患者在维罗非尼治疗中可获得临床应答。

（1）BRAF基因突变的检测用于预测结直肠癌抗EGFR单克隆抗体靶向药物的治疗效果和预后，必要时必须结合NRAS、KRAS、PI3KCA等基因的突变的检测。（2）研究发现黑色素瘤患者BRAFV突变位点外，如携带BRAFL和K突变可能对BRAF抑制剂药物维罗非尼药物治疗敏感，但目前还需进一步开展研究来证实这些发现。

A.1.4C-KIT基因突变检测

C-KIT基因位于人染色体4q11-21，属于原癌基因，其cDNA全长共bp，含有21个外显子，编码一个KD的跨膜酪氨酸激酶受体(tyrosinekinasereceptor，RTK)蛋白，命名CD。第1号外显子编码起始密码子和信号肽，第2-9号密码子编码膜外配体结构域，第10号外显子编码疏水跨膜结构域，第11-20号外显子编码膜内结构域。其中11号外显子编码近膜区段。C-KIT受体属于III型RTK家族，分布于细胞表面，可以用CD单克隆抗体检测，与血小板衍生生长因子受体(platelet-derivedgrowthfactorreceptors，PDGFR)有很强的同源性。

多数胃肠道间质瘤（GIST）发生源于C-KIT基因突变，C-KIT突变主要发生在近膜区的外显子11，然后是外膜区的外显子9，酪氨酸区段的外显子13、14、17也可以发生突变。最近数据显示，约8~50%的大肿瘤GIST中可观察到典型的突变，突变频率约35%。在不同GIST中，C-KIT基因突变型式并不完全一样，最常见为第11号外显子突变，导致其编码的近膜结构域的空间结构改变，消弱或丧失对激酶结构域的抑制功能。

甲磺酸伊马替尼（Imatinibmesylate）（商品名：格列卫）是一种口服的酪氨酸激酶抑制剂类药物，能够有效地选择性抑制所有类型的abl酪氨酸激酶活性，包括v-abl、PDGFR和C-KIT蛋白等。伊马替尼于年5月在美国上市，同年11月在欧洲上市，并于年4月在中国上市。最初被应用于费城染色体阳性的（Ph+）慢性粒细胞白血病（CML）的治疗，之后被批准用于胃肠道间质瘤的治疗，使得GIST治疗进入了分子靶向时代。

一般认为C-KIT/PDGFRA突变类型可以预测伊马替尼的疗效，其中C-KIT外显子11突变者的疗效最佳；PDGFRADV突变可能对伊马替尼与舒尼替尼原发耐药。舒尼替尼治疗GIST原发C-KIT外显子9突变者和C-KIT野生型者优于C-KIT外显子11突变患者；治疗继发性C-KIT外显子13、14突变患者疗效优于继发C-KIT外显子17、18突变者。

CSCO胃肠间质瘤专家委员会推荐存在以下情况时，应该进行基因学分析：①所有初次诊断的复发和转移性GIST，拟行分子靶向治疗；②原发可切除GIST手术后，中-高度复发风险，拟行伊马替尼辅助治疗；③对疑难病例应进行C-KIT或PDGFRA突变分析，以明确GIST的诊断；④鉴别NF1型GIST、完全性或不完全性Carney’s三联征、家族性GIST及儿童GIST；⑤鉴别同时性和异时性多原发GIST。

检测基因突变的位点，至少应包括C-KIT基因的第9、11、13和17号外显子及PDGFRA基因的第12和18号外显子。由于大多数GIST（65～85%）的基因突变发生在C-KIT基因的第11号或第9号外显子，对于经济承受能力有限的患者，在鉴别诊断时，可以优先检测这两个外显子；但是，对于继发耐药的患者，宜增加检测C-KIT基因的13、14、17和18外显子。

经10%中性福尔马林固定石蜡包埋的GIST肿瘤组织。推荐检测的样本类型为治疗前的原发癌肿瘤组织或转移的肿瘤组织。

C-KIT基因突变的检测方法可以采用Sanger测序法、ARMS-PCR等方法检测特定的突变位点。

（1）辅助诊断和预测疗效：伊马替尼是一种酪氨酸蛋白酶抑制剂，能阻断酪氨酸蛋白激酶KIT受体功能，从而抑制肿瘤的形成。已有研究证实，C-KIT基因突变的位置能影响肿瘤患者对伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂的反应。通过检测C-KIT基因的突变状态，协助GIST诊断，也可以进一步的明确诊断CD阴性的患者，诊断家族性GIST，评价小儿GIST，指导化疗，预测化疗的效果。（2）预后评价：当C-KIT基因第11外显子发生突变后，患者预后较发生于C-KIT基因其他外显子或PDGFRA基因突变的患者或者未检测到C-KIT基因或PDGFRA基因突变的患者预后更差。来源于小肠或结肠的CIST如发生C-KIT基因第9外显子突变，较发生C-KIT基因第11外显子突变者更具有侵袭性。

伊马替尼、苏坦替尼等酪氨酸激酶抑制剂与C-KIT基因发突变密切相关，对发生于外显子9、11、12和17的原发性突变患者，使用伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂时，患者可从抗C-TKI靶向药物治疗中获益。当发生位于第13、14、17、18外显子的继发性突变时，则使用伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂出现耐药。

由于存在肿瘤异质性，或肿瘤组织中混有大量正常组织，或坏死组织过多等，均有可能导致假阴性结果的产生。同时还有部分患者无法提供检测所需的组织样本，或组织样本无法满足检测的基本要求，或患者病情发展及治疗过程中会发生C-KIT基因状态的变化，均可导致治疗的失败。此外，C-KIT基因的突变与伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂敏感性之间的关系因人而异。伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂在体内的代谢受CYPA4状态的影响，因此即使C-KIT基因突变阳性的患者，伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂亦不一定能达到预期临床疗效，需要考虑其他因素的干扰。

A.1.5PDGFRA基因

PDGFR是分子量为kD的单链膜糖蛋白，细胞外配体结合区含5个免疫球蛋白样结构域，具保守的半胱氨酸残基，单一跨膜片段；胞内的酪氨酸激酶区断裂处，为亲水氨基酸插入序列。受体分子由α，β两种亚基组成，成熟后的PDGFR以二聚体稳态形式(αα，αβ，ββ)与配体PDGF(platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)相应异构体(PDGF-AA，AB，BB)结合。结直肠癌组织中PDGFRα和PDGFRβ均有表达分布，PDGFRα分布于结直肠正常组织、息肉组织及肿瘤组织上；PDGFRβ表达于肿瘤细胞、肿瘤间质细胞和微血管细胞（包括微血管周细胞）上。

PDGFRA基因突变常见于GIST、胶质母细胞瘤、恶性外周神经鞘等肿瘤，其中GIST中PDGFRA基因突变率在5~10%左右，突变主要发生于PDGFRA基因的近膜端区域(外显子12)和激酶区(外显子14和外显子18)，突变频率分别为0.8%和3.9%，其中以外显子18突变为主。PDGFRA常见突变类型见。PDGFRA基因突变后则通过活化AKT、MAPK及STAT蛋白中STAT1和STAT3发挥作用。也有研究发现活化的A-Raf激酶能调节PLCG1经PDCFR依赖途径的信号转导，也能调节PI3K经PDCFR非依赖的信号转导。

经10%中性福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织。推荐检测的样本类型治疗前的原发癌肿瘤组织或转移的肿瘤组织。

PDGFRA基因突变的检测方法可以采用Sanger测序法、ARMS-PCR等方法检测特定的突变位点。

（1）辅助诊断和预测疗效：伊马替尼是一种酪氨酸蛋白酶抑制剂，能阻断酪氨酸蛋白激酶KIT受体功能，从而抑制肿瘤的形成。已有研究证实，PDGFRA基因突变的位置能影响肿瘤患者对伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂的反应。研究表明，PDGFRA基因外显子12和外显子18大部分基因位点突变后使用伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂治疗时GIST患者可从中获益。但如外显子18基因位点发生DV、RD-KI或D1-IM突变使用伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂治疗时GIST患者不能从中获益。（2）预后评价：当PDGFRA基因发生突变后，肿瘤侵袭性较发生于KIT基因突变的患者侵袭性低。

伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酿激酶抑制剂与PDGFRA基因发突变密切相关，对发生于外显子12中的TyrCys和Asp56lVal突变及外显子18中的AspTyr等突变患者，使用伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂时，患者可从中获益。当位于第18外显子中的DV、RD-KI和DI-IM突变时，使用伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂则出现耐药。

由于存在肿瘤异质性，或肿瘤组织中混有大量正常组织，或坏死组织过多等，无法避免假阴性结果的产生。同时还有部分患者无法提供检测所需的组织样本，或组织样本无法满足进行检测的基本要求，或患者病情发展及治疗过程中会发生PDGFRA基因状态的变化，均可导致治疗的失败。此外，PDGFRA基因突变与伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂敏感性之间的关系因人而异。同时伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂在体内的代谢受CYPA4状态的影响，即使检测到了PDGFRA基因的突变，使用伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂不一定能达到预期临床疗效，需要考虑其他因素的干扰。

A.2基因表达检测项目A.2.1HER2基因表达

原癌基因HER2位于染色体17q21，习惯上称为HER2／neu基因或c-erbB-2基因。编码分子量kD的跨膜蛋白，因此又被称为pHER2，是具有跨膜酪氨酸激酶活性的生长因子受体。HER2受体介导的信号通路是一个复杂的网络系统，包括输入细胞层(配体或生长因子)、信息加工层(受体，SH2蛋白，转录因子)和输出层(细胞生长，分化和转移)。配体介导受体的二聚体是关键，使该信号系统能够传递多种生物信息，而缺乏特异性配体的HER2在整个信号网络中起调节作用。信号转导涉及的主要通路包括：Ras、Raf-Mek-MAPK、PBK、Akt激酶、cAMP(蛋白激酶A)、磷脂酶C-r和src等。HER2通过这些信号转导通路使细胞增殖周期变短，恶性表现增强和抗凋亡。

HER2基因在乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、胃癌和非小细胞肺癌等中均存在表达上调。许多研究资料表明，在20～30%的乳腺癌中存在HER2基因明显扩增或过表达，临床上HER2基因过表达的乳腺癌患者往往表现出生存率低、肿瘤恶性程度增强、进展迅速、易于发生淋巴结转移、化疗缓解期缩短，并对他莫昔芬(Tamoxifen)和很多细胞毒性化疗药耐药等，但对大剂量蒽环类、紫杉类药物疗效好。由于HER2基因位于细胞表面，易被抗体接近，故HER2基因可作为抗肿瘤治疗的一个靶点。

经10%中性福尔马林固定石蜡包埋的乳腺癌肿瘤组织。治疗前的原发肿瘤组织或转移的肿瘤组织。

对HER2基因表达的检测方法可以采用FISH、IHC、扩增显色原位杂交（CISH）等，目前也有实验室使用荧光定量PCR等方法进行检测，但该方法用于检测HER2基因的表达尚未得到认可。一般来说，实验室首先采用IHC方法进行HER2蛋白检测，如果检测结果为2+，则进行原位杂交(FISH)方法进行HER2基因检测确认。

免疫组织化学（IHC）检测：

1）3+，HER2表达阳性；

2）1+或阴性，表达阴性；

3）2+时则需要进行FISH检测。

FISH检测：

1）HER2与CEP17信号数比值：≥2.0为阳性，有HER-2/neu基因扩增；

2）HER2与CEP17信号数比值：＜2.0时，

若HER2拷贝数≥6.0为阳性，有HER-2/neu基因扩增；

若HER2拷贝数＜4.0为阴性，无HER-2/neu基因扩增；

若HER2拷贝数≥4.0，但＜6.0时为不确定，不能确定HER-2/neu基因状态。

3）若众多信号HER2信号连接成簇时可不计算，即视为基因扩增。

准确分析HER2基因扩增状态是乳腺癌患者预后判断及制订有效治疗方案的先决条件，对乳腺癌的诊疗具有重要的指导作用。

（1）预后评价：研究显示，HER2基因的过表达除了与肿瘤的发生发展相关外，还是一个重要的临床预后指标，主要表现为HER2基因扩增的乳腺癌浸润性强、无进展生存期(progressfreesurvival、PFS)短、预后差。而且这部分患者就诊时的肿瘤负荷更大，淋巴结转移的几率更高，激素受体阴性的比例更高、组织学分级更差、肿瘤的增殖指数更高、复发风险更高。但没有证据显示HER2基因扩增与导管原位癌(ductalcarcinomainsitu，DCIS)的预后相关。

（2）内分泌药物疗效预测：研究显示，相对于无HER2基因扩增的乳腺癌患者而言，HER2基因扩增的患者应用他莫昔芬治疗后的死亡风险明显增高，因此这类乳腺癌患者可能不适合选择他莫昔芬作为内分泌治疗，而且HER2基因扩增的乳腺癌患者对CMF化疗方案的反应性降低，宜采用高剂量的蒽环类药物方案。

（3）靶向药物疗效预测：大量临床研究数据提示，使用曲妥珠单克隆抗体等治疗乳腺癌时，无论是与常规化疗联合用于乳腺癌患者的辅助治疗，还是用于辅助治疗后的维持治疗，及用于晚期乳癌患者的单药或联合治疗，都能肯定改善HER2基因扩增或蛋白过表达患者的生存，使乳腺癌患者获益。

即使在使用曲妥珠单抗治疗过程中出现疾病进展而需要进一步治疗的乳腺癌患者，继续使用曲妥珠单抗治疗仍然有效。而对于HER2基因低度扩增或不扩增的乳腺癌患者，使用曲妥珠单抗疗效不佳。

曲妥珠单抗及拉帕替尼等酪氨酸激酶抑制剂等乳腺癌靶向药物治疗乳腺癌的疗效与HER2基因表达状态密切相关，当HER2基因扩增时，使用曲曲妥珠单抗和拉帕替尼等酪氨酸激酶抑制剂时，患者可从抗HER2靶向药物治疗中获益。但如果发生PI3KCA基因突变、PTEN基因失活及HER2基因某些位点发生突变时，则会对曲妥珠单抗和拉帕替尼等酪氨酸激酶抑制剂耐药。

由于方法学本身的局限性，IHC和FISH得出的均有不确定结果，无法对HER2基因状态做出明确判断。即使经IHC或FISH判断为HER2基因过表达的患者也未必一定能从靶向治疗中获益，导致这种现象的原因可能是检测体系本身所造成的假阳性，也可能是HER2基因的信号通路中还存在其他异常的位点。其次肿瘤异质性的存在导致IHC和FISH均无法避免假阴性结果的产生。还有部分患者无法提供检测所需的组织样本，或组织样本无法满足进行检测的基本要求，或患者病情发展及治疗过程中会发生HER2基因状态的变化，而IHC和FISH均无法对患者的HER2基因状态进行动态、实时的监测。

A.3融合基因检测项目A.3.1EML4-ALK融合基因检测项目

ALK，即人类间变性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase，ALK)，于年首先发现于间变性大细胞淋巴瘤AMS3细胞株中，是由个氨基酸组成的跨膜蛋白，属于胰岛素受体家族。EML4是人类棘皮动物微管相关蛋白样4(echinodermmicrotubule-associatedprotein-like4，EML4)，属于棘皮动物微管相关蛋白样蛋白家族，由N末端碱基区、疏水的棘皮动物微管相关蛋白区(hydrophobicechinodermmicrotubule-associatedprotein-likeprotein，HELP)及WD重复区三部分构成。该融合基因定位于2号染色体的短臂上(2p21和2p23)，其5’端为EML4的片段，3’端为ALK的片段，由倒置后的EML4基因片段与残余的ALK片段连接。该融合基因拥有EML4基因中的BASIC区域，疏水的棘皮动物微管相关蛋白区及部分WD重复区(后两部分在部分亚型中缺失)和ALK基因中的Kinase功能区。EML4-ALK的信号转导通路为PI3-K/Akt、STAT3/5、Ras-MEK和PLC-γ/PIP2等，这些通路与细胞存活、增殖和迁移密切相关。

克唑替尼是一种酪氨酸激酶受体抑制剂，靶向分子包括ALK、肝细胞生长因子受体（HGFR，c-Met）和ROS1，于年获得美国食品和药品管理局（FDA）批准用于治疗间变型淋巴瘤激酶（ALK）基因重排的非小细胞肺癌（NSCLC）。EML4-ALK基因融合可促使ALK基因引起致癌融合蛋白的表达。ALK融合蛋白形成可引起基因表达和信号的激活和失调，进而促使表达这些蛋白的肿瘤细胞增殖和存活。克唑替尼在肿瘤细胞株中对ALK和c-Met在细胞水平检测的磷酸化具有浓度依赖性抑制作用，对表达EML4-ALK或NPM-ALK融合蛋白或c-Met的异种移植荷瘤小鼠具有抗肿瘤活性在NSCLC患者中，ALK重排的阳性率大约为3～5%，在腺癌、从未吸烟或少量吸烟的患者中EML4-ALK融合的几率高。

经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋的非小细胞肺癌肿瘤组织。推荐检测的样本为治疗前的原发癌肿瘤组织或转移的肿瘤组织

EMIA-ALK融合基因的检测方法有FISH、IHC、荧光定量PCR等，推荐的检测方法为FISH。

（1）预测药物疗效：EMLA-ALK融合基因阳性的NSCLC患者接受以铂类为基础的化疗，其有效率、疾病进展时间和总生存期与EGFR突变阳性NSCLC患者相似。相反，EML4-ALK融合基因阳性患者不能从EGFR-TKI的基础治疗中受益，表现为原发耐药，治疗结果与无EGFR基因突变的患者相似。而针对EML4-ALK融合基因阳性的患者，使用克唑替尼等针对ALK基因的小分子抑制剂可以获得良好的临床治疗效果。因此在使用针对ALK基因的小分子抑制剂前，需进行EML4-ALK融合基因突变的检测。

针对ALK基因的小分子抑制剂疗效与EML4-ALK融合基因密切相关，当存在EML4-ALK融合基因时，可以考虑使用针对ALK基因的小分子抑制剂治疗如克唑替尼，患者可以从中获益，而不应给予吉非替尼、厄洛替尼等EGFR-TKI类药物，患者不会从中获益。

由于EML4-ALK融合基因检测方法FISH、IHC和RT-PCR检测的灵敏度不足及检测样本受正常组织干扰等因素的影响，容易造成检测结果的假阴性。同时EML4-ALK融合基因各种亚型患者在接受克唑替尼治疗时是否存在疗效差异尚不明确，也有待进一步研究。因此，使用克唑替尼治疗EML4-ALK融合基因阳性的NSCLC患者时，需要定期监测疗效。

A.4基因甲基化检测项目A.4.1MGMT基因甲基化检测

人MGMT基因稳定地存在于所有正常组织细胞内，其编码的MGMT蛋白以分布在人体肝脏的活性最高，其次为淋巴结和肠道，骨髓细胞中的活性最低。MGMT蛋白在不需要任何辅助因子或其他蛋白质的条件下，可以催化DNA分子中鸟嘌呤O6位上的烷基转移至MGMT本身第位的半胱氨酸残基上，鸟嘌呤损伤修复，DNA的结构和功能得以恢复。同时，这种催化作用是一种不可逆的反应，MGMT作用后由于获得烷基而失活，因此这种酶又是一种自杀蛋白。正常情况下，细胞内MGMT具有解除烷化剂对细胞的致癌作用和消除烷化类药物对于细胞毒性杀伤作用的双重生物学功能，而细胞对DNA鸟嘌呤O6位上烷基化修复能力的大小通常取决于MGMT在细胞内的含量和合成的速率。

影响机体MGMT含量和活性的因素有很多，环境因素、机体器官状态和基因状态等。其中基因调节是影响MGMT蛋白含量和活性的主要因素，MGMT基因启动子甲基化是MGMT最常见的异常，多发生于MGMT启动子CpG岛，导致该基因转录停止，表达减少。许多肿瘤如脑胶质瘤、结直肠癌、肺癌、乳腺癌中存在MGMT基因甲基化并均可观察到MGMT启动子异常甲基化，启动子甲基化与19号染色体长臂丢失或19号染色体长臂与1号染色体短臂杂合丢失有关。如p53基因突变后能导致肿瘤细胞MGMT表达减少，活性降低。许多机体环境因素也影响MGMT蛋白的含量和活性，如乙基亚硝基脲、吸烟等可以使肝细胞中的MGMT蛋白表达量和活性明显增加。MGMT启动子发生甲基化的患者才可以从替莫唑胺治疗中受益。

正常人群基因组中MGMT基因启动子CpG位点为非甲基化状态，如果检测到基因组中存在MGMT基因启动子CpG位点的甲基化，提示MGMT基因编码MGMT蛋白的功能下降或MGMT活性降低。

经10%中性福尔马林固定石蜡包埋的脑胶质瘤肿瘤组织或者病理确证的活检组织。推荐检测的样本类型为治疗前的原发癌肿瘤组织。

MGMT基因启动子甲基化的检测方法建议采用MSP(methyl-specificpolymerasechainreaction，甲基化特异的PCR)、甲基化特异性焦磷酸测序、HRM等方法。

（1）疗效预测：MGMT启动子发生甲基化的患者明显比未发生甲基化的患者使用烷化剂的疗效好，其总体生存率和无进展生存率更高。MGMT启动子区甲基化对胶质瘤一线化疗药物TMZ治疗胶质瘤的化疗疗效具有预测价值，且是独立的预后较好的指示指标。MGMT启动子未甲基化者从TMZ常规治疗方案中获益较小，应对这类患者采用更有效的有助于克服耐药的其他化疗方案。（2）预后评价：40%脑胶质瘤患者有MGMT启动子甲基化，甲基化程度越高，预后越差，其对肿瘤的预后和生存期的预示作用较肿瘤的分级、临床、年龄等其他特征更有效。

TMZ等烷化剂疗效与MGMT启动子区域甲基化状态密切相关，对发生了MGMT启动子区域甲基化的患者，且发生甲基化比例越高的患者，使用TMZ烷化剂治疗时，患者可从中获益。如未发生MGMT启动子区域甲基化的患者，使用TMZ烷化剂治疗则出现耐药。

由于脑部肿瘤的特殊性，限制了肿瘤组织的来源，同时肿瘤组织的异质性、大量坏死组织或大量正常组织的存在，干扰了检测结果，导致检测结果的假阴性。同时，MGMT启动子区域甲基化程度与TMZ烷化剂的疗效之间的关系尚未阐明，MGMT基因表达水平也影响了TMZ烷化剂的疗效，且TMZ疗效也受其他因素的影响，因此尚不能根据MGMT启动子甲基化状态判断TMZ的疗效，仅仅是根据是否存在甲基化对TMZ的疗效进行预测。

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